ONDERZOEKSMETHODEN: THEMA 1 LABBUDDY
DOELSTELLING ONDERZOEK
Een bacterie is niet pathogeen door een virulentie factor maar door heel veel verschillende. Een
humane pathogene bacterie groeit bij 37 graden en het MO heeft mechanismen om door het lichaam
te circuleren. Als er een infectie optreedt (wat dus niet altijd het geval is) zal het belangrijk zijn om
het profiel van de bacterie op te sporen en te checken voor eventuele antibiotica resistentie.
DAG 1 – KAPSELDETECTIE
Kapseldetectie - theorie
De meeste bacteriën bevatten naast een celmembraan ook een celwand, gemaakt uit
peptidoglycanen, dat een extra laag van bescherming biedt. De celwand helpt de bacterie om zijn
vorm te behouden en om uitdroging te voorkomen.
Naast een celmembraan en celwand hebben veel bacteriën nog een extra laag, het kapsel
genaamd.
Bij de kapseldetectie wordt gekeken of de bacterie een kapsel bevat of niet.
Het kapsel is niet van levensbelang voor de bacterie, er geldt alleen dat bacteriën zonder kapsel
minder virulent zijn. De levenskrachtigheid van bacteriën met of zonder kapsel is gelijk.
Functies van het kapsel:
o Betere bescherming tegen de afweer van de gastheer
o Schadelijke stoffen (zoals desinfectiemiddel) bereiken de bacterie minder goed
o De bacterie kan zich beter hechten en is moeilijker te verwijderen van harde oppervlakken.
Kapseldetectie - protocol
Het aantonen van een eventueel aanwezig kapsel gebeurt middels een negatieve kleuring.
Voor het experiment worden vloeibare cultures gebruikt die in de 37C stoof zijn. Een negatieve
kleuring houdt in dat juist de omgeving van de cel wordt gekleurd en niet de cel zelf. Het kapsel kan
niet gekleurd worden door de samenstelling en dat is dan ook de rede dat een negatieve kleuring
nodig is.
1. Maak een 10x verdunning van de vloeibare bacterie
o Dit is om de stockoplossing te maken
2. Pipetteer 25 µL Oost-Indische inkt op het rechter uiteinde van een objectglas.
o Dit heeft als doel om de omgeving van de cellen te kleuren
3. Pipetteer 10 µL van de 10x verdunde bacterieculture in de inktdruppel en meng goed.
4. Neem een tweede objectglas en zet dit onder een hoek van 30° even links van de inktdruppel met
cellen. Breng het schuine glas voorzichtig naar de druppel toe zodat deze in de punt van de scherpe
hoek uitvloeit en beweeg het schuine glas nu naar links om het monster uit te smeren. Laat het
preparaat goed drogen.
5. Pipetteer voorzichtig een druppel methanol op het preparaat en incubeer gedurende 5 minuten.
Laat het preparaat aan de lucht drogen
o Deze stap is om het preparaat te fixeren zodat er geen biologische processen meer plaats
vinden. Het vangt de vrije watermoleculen weg en dat zorgt voor het denatureren van de
eiwitten die daardoor hun werk niet kunnen doen.
6. Kleur de cellen met fuschine gedurende 1 min. Spoel de fuschine vervolgens weg en maak het
preparaat droog
o Fuschine kleurt de cellen zelf dus nu is zowel de omgeving als de cellen aangekleurd. Een
eventuele ongekleurde rand rondom de cellen toont de aanwezigheid van een kapsel aan.
,Kapseldetectie – analyse protocol
1. Leg het preparaat onder de microscoop en kies het 10x objectief om de
cellen te zoeken en scherp te stellen
2. Draai voorzichtig het 40x objectief door en stel scherp
3. Breng olie aan op het preparaat en draai voorzichtig het 100x objectief
erboven
o De olie is om een beschermend laagje te vormen als het ware
4. Hier rechts is een bacterie te zien die duidelijk een kapsel heeft; er is een
kleurloos laagje te zien wat komt doordat het kapsel geen kleurstof
opneemt.
DAG 1 – GRAMKLEURING
Gramkleuring - theorie
Ook voor dit experiment gebruik je de voorgegroeide vloeibare cultures van bacteriën.
Bij de gram kleuring kunnen bacteriën in groepen gescheden worden. Dit wordt gedaan met
behulp van kristalviolet, jodium, alcohol en fuschine. Dit kan dan onder de microscoop
geanalyseerd worden.
o Grampositieve bacteriën: blauw/paars
o Gramnegatieve bacteriën: rood/roze
In grampositieve bacteriën is de bacterie omgeven door een dikke
peptidoglycaan laag die het beschermt tegen de omgeving. De
peptidoglycaanlaag zorgt voor rigiditeit en geeft de bacterie zijn vorm.
-> In de peptidoglycaan laag bevinden zich ook de teichoische zuren. Zij
hebben veel functies waaronder het beschermen tegen stoffen die
schade aanbrengen, het vastzetten van de peptidoglycaanlaag aan de
plasma membraan en het stabiliseren van de celwand.
In de gram negatieve bacteriën zijn lipopolysacharides te vinden in de
buitenmembraan. Zij zijn erg negatief geladen wat daardoor bijdraagt
aan de vorm van de bacterie. Lipopolysacharide zijn belangrijk omdat zij
kunnen leiden tot een toxische schock bij de gastheer. Gramnegatieve
bacteriën zijn moeilijker te behandelen dan gram positieve
Kennisclip
Eerst worden cellen van een cultuur naar een glazen plaatje over gebracht. Als het op een agar plaat
is moet het eerst naar een vloeibaar medium. Hoe ouder cellen, hoe minder goed ze kleuren dus ze
moeten vers zijn. Het wordt gefixeerd door het boven een brander te houden. De cellen worden met
kristalviolet gekleurd voor 20-40 sec. Alle cellen zijn nu paars. Dan gram iodine op de cellen voor een
minuut. De cellen zijn nog steeds paars. Er wordt dan de kleuring weggespoeld door ethanol of
aceton. Gram positief houdt kristal violet vast en gram negatief niet. Gram positieve kunnen de
kleuring ook kwijtraken als er te veel wordt gespoten. Onder de microscoop zijn de gram positieve nu
paars en gram negatief zijn kleurloos. Dan wordt het preparaat gekleurd met safranin voor 20-30 sec
en hierdoor wordt gram negatief roze. Nu zijn de cellen te onderscheiden van elkaar. In gram
positieve bacteriën krimpt de peptidoglycanen wand door ethanol en behoudt de kleur. Het is een
permeabele cel, dus krijgt het kleur. In gram negatief is het heel dun en zijn er grote poriën te vinden.
Ethanol trekt lipide eruit en daarmee wordt kristalviolet ook uit de cel getrokken waardoor gram
negatieve bacteriën dan kleurloos worden.
Gramkleuring - protocol
Voor de gramkleuring is dus een preparaat met bacteriecellen nodig. Op een glaasje kunnen 2/3
preparaten tegelijk gemaakt worden.
, Voorbereiden preparaten
1. Breng met een pipet 10µL van de verdunde bacterieculturen op een object glas
2. Breidt de suspensie met een entoog uit over een oppervlak ter grootte van een cent. Omcirkel het
preparaat aan de onderkant van het glaasje met viltstift en merk het glaasje. Laat de suspensie
drogen aan de lucht.
3. Fixeer het preparaat door deze driemaal gedurende een halve seconde door de vlam te halen
Gramkleuring
4. Kleur het preparaat met kristalviolet gedurende 3 minuten
o Kristalviolet kleurt de peptidoglycaanlaag in de celwand van de bacteriën blauw/paars
5. Giet de kristalvioletoplossing af en was voorzichtig met water. Incubeer vervolgens met de jodium-
oplossing gedurende 3 minuten.
o Jodium vormt een complex met kristalviolet en fixeert daarmee de kleuring binnen de
peptidoglycaanlaag.
6. Giet de jodiumoplossing af en spoel voorzichtig met water
7. Spoel met ontkleuringsvloeistof (70% ethanol) totdat er geen kleurstof meer van het preparaat
afloopt. Spoel na met water
o Ethanol spoelt de paas/blauwe kleur bij de Gramnegatieve bacteriën weg. In bacteriën met
een dikke peptidoglycaanlaag in hun celwand is het moeilijker de kleuring weg te spoelen en
zal de paarse kleur zichtbaar blijven (=Gram-positieve bacteriën).
8. Kleur de preparaten na met een oplossing van fuchsine in water gedurende 60 sec.
o Fuchsine kleurt de bacteriën die niet paars/blauw zijn roze/rood aan, zodat ze goed zichtbaar
zijn onder de microscoop.
Gramkleuring – analyse protocol
o
1. Leg het preparaat onder de microscoop. Kies het 10x objectief om de cellen te zoeken en scherpt
te stellen
2. Draai voorzichtig het 40x objectief door. Stel weer scherp
3. Bepaal of de cellen positief of negatief zijn. Noteer de bevindingen in je labjournaal
4. Breng olie aan op je preparaat en draai voorzichtig het 100x objectief erboven. Stel scherp.
5. Bestuur de vorm en kleur van cellen
DAG 1 – PROTEASE-ACTIVITEIT
Protease-activiteit - theorie
Hier worden weer voorgegroeide culturen gebruikt, dit keer op de platen.
Bacteriën kunnen proteases uitscheiden en daarmee weefselschade toebrengen. In dit
experiment wordt gekeken welke bacterie dat doet. Proteasen zijn enzymen die in staat zijn om
eiwitten af te breken door bindingen tussen aminozuren te verbreken. Ze verbreken hierbij
peptidebindingen door een watermolecuul toe te voegen. Dit proces wordt hydrolyse genoemd.
Protease-activiteit – protocol
1. Haal de stockplaten uit de stoof. Neem een monster van elke bacteriestock en breng deze als een
rondje aan op een vierkante plaat.
o Een melkplaat bevat veel eiwitten die door de proteasen van de bacteriën kunnen worden
afgebroken.
2. Incubeer de plaat overnacht bij 37°C.
o Wanneer er sprake is van protease-activiteit, zullen de bacteriën de melk uit de
voedingsbodem afbreken. Hierdoor ontstaat een halo rondom de kolonie. Dit is te
herkennen aan het feit dat de witte melkkleur verdwijnt
DOELSTELLING ONDERZOEK
Een bacterie is niet pathogeen door een virulentie factor maar door heel veel verschillende. Een
humane pathogene bacterie groeit bij 37 graden en het MO heeft mechanismen om door het lichaam
te circuleren. Als er een infectie optreedt (wat dus niet altijd het geval is) zal het belangrijk zijn om
het profiel van de bacterie op te sporen en te checken voor eventuele antibiotica resistentie.
DAG 1 – KAPSELDETECTIE
Kapseldetectie - theorie
De meeste bacteriën bevatten naast een celmembraan ook een celwand, gemaakt uit
peptidoglycanen, dat een extra laag van bescherming biedt. De celwand helpt de bacterie om zijn
vorm te behouden en om uitdroging te voorkomen.
Naast een celmembraan en celwand hebben veel bacteriën nog een extra laag, het kapsel
genaamd.
Bij de kapseldetectie wordt gekeken of de bacterie een kapsel bevat of niet.
Het kapsel is niet van levensbelang voor de bacterie, er geldt alleen dat bacteriën zonder kapsel
minder virulent zijn. De levenskrachtigheid van bacteriën met of zonder kapsel is gelijk.
Functies van het kapsel:
o Betere bescherming tegen de afweer van de gastheer
o Schadelijke stoffen (zoals desinfectiemiddel) bereiken de bacterie minder goed
o De bacterie kan zich beter hechten en is moeilijker te verwijderen van harde oppervlakken.
Kapseldetectie - protocol
Het aantonen van een eventueel aanwezig kapsel gebeurt middels een negatieve kleuring.
Voor het experiment worden vloeibare cultures gebruikt die in de 37C stoof zijn. Een negatieve
kleuring houdt in dat juist de omgeving van de cel wordt gekleurd en niet de cel zelf. Het kapsel kan
niet gekleurd worden door de samenstelling en dat is dan ook de rede dat een negatieve kleuring
nodig is.
1. Maak een 10x verdunning van de vloeibare bacterie
o Dit is om de stockoplossing te maken
2. Pipetteer 25 µL Oost-Indische inkt op het rechter uiteinde van een objectglas.
o Dit heeft als doel om de omgeving van de cellen te kleuren
3. Pipetteer 10 µL van de 10x verdunde bacterieculture in de inktdruppel en meng goed.
4. Neem een tweede objectglas en zet dit onder een hoek van 30° even links van de inktdruppel met
cellen. Breng het schuine glas voorzichtig naar de druppel toe zodat deze in de punt van de scherpe
hoek uitvloeit en beweeg het schuine glas nu naar links om het monster uit te smeren. Laat het
preparaat goed drogen.
5. Pipetteer voorzichtig een druppel methanol op het preparaat en incubeer gedurende 5 minuten.
Laat het preparaat aan de lucht drogen
o Deze stap is om het preparaat te fixeren zodat er geen biologische processen meer plaats
vinden. Het vangt de vrije watermoleculen weg en dat zorgt voor het denatureren van de
eiwitten die daardoor hun werk niet kunnen doen.
6. Kleur de cellen met fuschine gedurende 1 min. Spoel de fuschine vervolgens weg en maak het
preparaat droog
o Fuschine kleurt de cellen zelf dus nu is zowel de omgeving als de cellen aangekleurd. Een
eventuele ongekleurde rand rondom de cellen toont de aanwezigheid van een kapsel aan.
,Kapseldetectie – analyse protocol
1. Leg het preparaat onder de microscoop en kies het 10x objectief om de
cellen te zoeken en scherp te stellen
2. Draai voorzichtig het 40x objectief door en stel scherp
3. Breng olie aan op het preparaat en draai voorzichtig het 100x objectief
erboven
o De olie is om een beschermend laagje te vormen als het ware
4. Hier rechts is een bacterie te zien die duidelijk een kapsel heeft; er is een
kleurloos laagje te zien wat komt doordat het kapsel geen kleurstof
opneemt.
DAG 1 – GRAMKLEURING
Gramkleuring - theorie
Ook voor dit experiment gebruik je de voorgegroeide vloeibare cultures van bacteriën.
Bij de gram kleuring kunnen bacteriën in groepen gescheden worden. Dit wordt gedaan met
behulp van kristalviolet, jodium, alcohol en fuschine. Dit kan dan onder de microscoop
geanalyseerd worden.
o Grampositieve bacteriën: blauw/paars
o Gramnegatieve bacteriën: rood/roze
In grampositieve bacteriën is de bacterie omgeven door een dikke
peptidoglycaan laag die het beschermt tegen de omgeving. De
peptidoglycaanlaag zorgt voor rigiditeit en geeft de bacterie zijn vorm.
-> In de peptidoglycaan laag bevinden zich ook de teichoische zuren. Zij
hebben veel functies waaronder het beschermen tegen stoffen die
schade aanbrengen, het vastzetten van de peptidoglycaanlaag aan de
plasma membraan en het stabiliseren van de celwand.
In de gram negatieve bacteriën zijn lipopolysacharides te vinden in de
buitenmembraan. Zij zijn erg negatief geladen wat daardoor bijdraagt
aan de vorm van de bacterie. Lipopolysacharide zijn belangrijk omdat zij
kunnen leiden tot een toxische schock bij de gastheer. Gramnegatieve
bacteriën zijn moeilijker te behandelen dan gram positieve
Kennisclip
Eerst worden cellen van een cultuur naar een glazen plaatje over gebracht. Als het op een agar plaat
is moet het eerst naar een vloeibaar medium. Hoe ouder cellen, hoe minder goed ze kleuren dus ze
moeten vers zijn. Het wordt gefixeerd door het boven een brander te houden. De cellen worden met
kristalviolet gekleurd voor 20-40 sec. Alle cellen zijn nu paars. Dan gram iodine op de cellen voor een
minuut. De cellen zijn nog steeds paars. Er wordt dan de kleuring weggespoeld door ethanol of
aceton. Gram positief houdt kristal violet vast en gram negatief niet. Gram positieve kunnen de
kleuring ook kwijtraken als er te veel wordt gespoten. Onder de microscoop zijn de gram positieve nu
paars en gram negatief zijn kleurloos. Dan wordt het preparaat gekleurd met safranin voor 20-30 sec
en hierdoor wordt gram negatief roze. Nu zijn de cellen te onderscheiden van elkaar. In gram
positieve bacteriën krimpt de peptidoglycanen wand door ethanol en behoudt de kleur. Het is een
permeabele cel, dus krijgt het kleur. In gram negatief is het heel dun en zijn er grote poriën te vinden.
Ethanol trekt lipide eruit en daarmee wordt kristalviolet ook uit de cel getrokken waardoor gram
negatieve bacteriën dan kleurloos worden.
Gramkleuring - protocol
Voor de gramkleuring is dus een preparaat met bacteriecellen nodig. Op een glaasje kunnen 2/3
preparaten tegelijk gemaakt worden.
, Voorbereiden preparaten
1. Breng met een pipet 10µL van de verdunde bacterieculturen op een object glas
2. Breidt de suspensie met een entoog uit over een oppervlak ter grootte van een cent. Omcirkel het
preparaat aan de onderkant van het glaasje met viltstift en merk het glaasje. Laat de suspensie
drogen aan de lucht.
3. Fixeer het preparaat door deze driemaal gedurende een halve seconde door de vlam te halen
Gramkleuring
4. Kleur het preparaat met kristalviolet gedurende 3 minuten
o Kristalviolet kleurt de peptidoglycaanlaag in de celwand van de bacteriën blauw/paars
5. Giet de kristalvioletoplossing af en was voorzichtig met water. Incubeer vervolgens met de jodium-
oplossing gedurende 3 minuten.
o Jodium vormt een complex met kristalviolet en fixeert daarmee de kleuring binnen de
peptidoglycaanlaag.
6. Giet de jodiumoplossing af en spoel voorzichtig met water
7. Spoel met ontkleuringsvloeistof (70% ethanol) totdat er geen kleurstof meer van het preparaat
afloopt. Spoel na met water
o Ethanol spoelt de paas/blauwe kleur bij de Gramnegatieve bacteriën weg. In bacteriën met
een dikke peptidoglycaanlaag in hun celwand is het moeilijker de kleuring weg te spoelen en
zal de paarse kleur zichtbaar blijven (=Gram-positieve bacteriën).
8. Kleur de preparaten na met een oplossing van fuchsine in water gedurende 60 sec.
o Fuchsine kleurt de bacteriën die niet paars/blauw zijn roze/rood aan, zodat ze goed zichtbaar
zijn onder de microscoop.
Gramkleuring – analyse protocol
o
1. Leg het preparaat onder de microscoop. Kies het 10x objectief om de cellen te zoeken en scherpt
te stellen
2. Draai voorzichtig het 40x objectief door. Stel weer scherp
3. Bepaal of de cellen positief of negatief zijn. Noteer de bevindingen in je labjournaal
4. Breng olie aan op je preparaat en draai voorzichtig het 100x objectief erboven. Stel scherp.
5. Bestuur de vorm en kleur van cellen
DAG 1 – PROTEASE-ACTIVITEIT
Protease-activiteit - theorie
Hier worden weer voorgegroeide culturen gebruikt, dit keer op de platen.
Bacteriën kunnen proteases uitscheiden en daarmee weefselschade toebrengen. In dit
experiment wordt gekeken welke bacterie dat doet. Proteasen zijn enzymen die in staat zijn om
eiwitten af te breken door bindingen tussen aminozuren te verbreken. Ze verbreken hierbij
peptidebindingen door een watermolecuul toe te voegen. Dit proces wordt hydrolyse genoemd.
Protease-activiteit – protocol
1. Haal de stockplaten uit de stoof. Neem een monster van elke bacteriestock en breng deze als een
rondje aan op een vierkante plaat.
o Een melkplaat bevat veel eiwitten die door de proteasen van de bacteriën kunnen worden
afgebroken.
2. Incubeer de plaat overnacht bij 37°C.
o Wanneer er sprake is van protease-activiteit, zullen de bacteriën de melk uit de
voedingsbodem afbreken. Hierdoor ontstaat een halo rondom de kolonie. Dit is te
herkennen aan het feit dat de witte melkkleur verdwijnt
