Onderzoekmethoden Thema 3 Proteomics en massaspectrometrie

PROTEOMICS EN MASSASPECTROMETRIE
HPLC EN SCHEIDING VAN PEPTIDEN VIA SCX EN RP
Basisprincipe van HPLC
• High performance/presure liquid chromatography
• Basisopstelling HPLC:
1. Mengkamer + pompen (Boven op de kast zitten twee buffervaten: buffer A en
buffer B)
2. Injectionvalve
3. Monsters (bv. 96-wellsplaat)
4. Kolom
5. Detector: detecteren peptiden door UV signaal te meten, 280 nm
6. Computer voor aansturing
• Buffer A en buffer B zorgen voor een gradiënt elutie -> peptides komen
in porties van de kolom af.
• De gradient elutie werkt via een injection valve: een rond ding met meerdere openingen die op
verschillende manieren verbonden kunnen worden.
• Stappen werking injection valve:
1. Monsters opbrengen
2. Kraan draaien: Peptiden
binden aan kolom
3. Volgens schema wisselen van
buffer A naar B
4. Sample wordt gescheiden op
de 96-wells plaat

Principe van scheiding via SCX
• Strong cation exchange
• Kolommateriaal dat peptiden
bindt op basis van hun lading
• Dragermateriaal van kolom bevat negatieve ladingen.
• Buffer A bevat 25 mM NaCl, 0,1% mierenzuur, pH = 3. Bij deze pH zijn alle peptiden
positief geladen: kleine peptiden (+), middel peptiden (++), grotere peptiden (+++).
→ Hoeveelheid + is afhankelijk van de samenstelling van aminozuren, niet de grote
van de peptiden.
• Buffer B bevat 300 mM NaCl, 0,1% mierenzuur, pH = 3.
o Na+ verdringt de binding tussen de kolom en de peptiden, meer Na+ is meer
verdringing
o Grotere peptides vereisen meer Na+ om de binding op te heffen
o Eerste piek -> +
o Tweede piek -> ++
o Derde piek -> +++
• In totaal worden er 40 fracties opgevangen.
→ De peptiden van het complexe monster zijn nu gescheiden op
basis van hun lading.

Principe van scheiding via RP
• Reversed phase liquid chromatography
• Het dragermateriaal bevat lange koolstofketens: C18-kolom
• Buffer A: 0,1% mierenzuur

, • Buffer B: 0,1% mierenzuur, 50% acetonitril (heel hydrofoob)
• C18 kolom is heel hydrofoob
• Peptiden zijn voor een groot deel hydrofoob, deze zullen binden aan
het dragermateriaal.
• Na+ en Cl- komen als eerst de kolom uit, deze hebben geen affiniteit
voor C18 ketens -> ontzouten monsters
• Hydrofobe gedeeltes binden aan de kolom:
o Relatief hydrofiele peptide heeft minder
acetonitril nodig om eraf te komen, hydrofoob
meer
o Dus eerste piek = hydrofiel en tweede piek =
hydrofoob
• Vanuit de kolom gaan de peptiden direct naar de MS
→ Je hebt de peptiden gescheiden op basis van
hydrofiel/hydrofobiteit

MASSASPECTROMETRIE
Basis MS
• Ionen in gasfase
o Vacuüm is heel belangrijk voor een MS
- ‘Pure’ peptide massa’s meten
- Geen interactie met moleculen uit de lucht (N2,
O2, CO2)
o Peptide-ionen gaan vanuit vloeistof naar gasfase =
electrospray ionisatie (ESI)
→ Peptide ion MOET in gasfase en in vacuüm zijn om gemeten te worden
• Massa analyse
o Analyse van de peptide massa’s -> meten van m/z
o Voorbeeld: massa peptide = 1000 Da
1xH+ aan peptide gebonden; lading peptide 1*; m/z = (1000+1)/1=1001
2xH+ aan peptide gebonden; lading peptide 2*; m/z = (1000+2)/2=501
• Ionen detector
o Ionen raken detector -> gegevens worden opgeslagen in de computer: m/z en hoeveelheid
ionen van éen soort
o Voorbeeld: de volgende aantallen pepides hebben de detector geraakt:
500.000x m/z 600; 20.000x m/z 800; 200.000x m/z 950




Electrospary ionisatie (ESI): ionisatie van peptide ionen
• Kenmerken peptiden