FLOWCYMETRIE
HOORCOLLEGE FLOWCYMETRIE
Betekenis flowcymetrie
• Flow: cellen in beweging
• Cyto: cellen
• Metry: meten
• Een technologie die gelijktijdig meerdere fysieke kenmerken van afzonderlijke deeltjes,
gewoonlijk cellen, meet en analyseert terwijl zij in een vloeistofstroom door een lichtbundel
stromen.
• De metingen worden per cel verricht op een routinesnelheid van 500 tot 4000 cellen per seconde
• FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting. Je meet dan niet alleen, maar je gaat ze ook sorteren.
Wat kunnen we analyseren met FC?
• Meercellige organisme
• Eukaryotische cellen
• Cellulaire organellen
• Bacteriën
• Liposomen
• Virussen
• Enkele moleculen
Wat kan FC ons vertellen over een cel?
• Relatieve grootte (Forward Scatter – FSC)
o Verstrooit licht
o Gerelateerd aan de celoppervlak
o Wordt in de lijn met het licht gemeten: Light Scatter Diode
• Relatieve interne complexiteit (Side Scatter – SSC)
o Gereflecteerd en gebroken licht
o Heeft te maken met cel granuliteit en complexiteit
o Wordt op 90 graden van de laser gemeten
• Relatieve fluorescentie intensiteit (FL1, FL2, FL3, FL4, etc.)
Scatter Plot
• Hoe groter de cel, hoe verder naar rechts de stop op de x-as zit.
• Hoe complexer de cel, hoe hoger deze op de y-as zit.
• Voorbeeld: lymfocyten, monocyten, granulocyten.
Fluorescentie
• De verschillende fluorochromen absorberen het laserlicht
(=excitatie/absorptie) en zenden licht uit met een hogere
golflengte (= emissie)
• Kleur (emissiegolflengte) van dit licht is afhankelijk van het
gebruikte fluorochroom.
• Een fluorescente groep wordt aangeslagen met de laser, deze
komt in een hogere energie staat, vervalt en emitteert licht met
ietjes minder energie, de golflengte wordt dus hoger.
• Mate van fluorescentie geeft maat van binding weer, laag en
hoog positief voor de marker
• Strokes shift: het verschil tussen de golflengte van absorptie en emissie
, •
Werking flowcell
• De cellen uit de monsterbuis worden in de mantelstroom geïnjecteerd.
• De stroom in een stroomcel is laminair: je zit in het midden van je sample.
• Het hydrodynamische focussing (concentratie op 1 plek) duwt de cellen om 1
lijn te vormen langs hun lange as (horizontaal)
• De vorm van de flowcel verstrekt de mogelijkheid voor hydrodynamisch
focussing van de cellen.
Werking flowcytometer
• Vloeistofsysteem
o Pomp brengt sheat fluid op druk
o Sheat fluid loopt door een filter
o Sheat fluid gaat door een flowcell
o Eindigt in afval vat
o Injectienaald injecteert in flowcell
o Verdwijnt hierna ook in afval vat
→ Om de cellen in te brengen en te focussen
voor ondervraging
• Hydrodynamic focusing
o In de flowcell is het belangrijk dat de
cellen een voor een door de laserstraal
gaan
o Je hebt een continue stroming van de
sheath vloeistof, je sample wordt daar met een iets hogere druk ingevoerd
o De sheath vloeistof drukt hierdoor de sample samen, omdat deze stromen niet mengen krijg
je laminaire stroming waarin alle cellen oplijnen.
HOORCOLLEGE FLOWCYMETRIE
Betekenis flowcymetrie
• Flow: cellen in beweging
• Cyto: cellen
• Metry: meten
• Een technologie die gelijktijdig meerdere fysieke kenmerken van afzonderlijke deeltjes,
gewoonlijk cellen, meet en analyseert terwijl zij in een vloeistofstroom door een lichtbundel
stromen.
• De metingen worden per cel verricht op een routinesnelheid van 500 tot 4000 cellen per seconde
• FACS: Fluorescence Activated Cell Sorting. Je meet dan niet alleen, maar je gaat ze ook sorteren.
Wat kunnen we analyseren met FC?
• Meercellige organisme
• Eukaryotische cellen
• Cellulaire organellen
• Bacteriën
• Liposomen
• Virussen
• Enkele moleculen
Wat kan FC ons vertellen over een cel?
• Relatieve grootte (Forward Scatter – FSC)
o Verstrooit licht
o Gerelateerd aan de celoppervlak
o Wordt in de lijn met het licht gemeten: Light Scatter Diode
• Relatieve interne complexiteit (Side Scatter – SSC)
o Gereflecteerd en gebroken licht
o Heeft te maken met cel granuliteit en complexiteit
o Wordt op 90 graden van de laser gemeten
• Relatieve fluorescentie intensiteit (FL1, FL2, FL3, FL4, etc.)
Scatter Plot
• Hoe groter de cel, hoe verder naar rechts de stop op de x-as zit.
• Hoe complexer de cel, hoe hoger deze op de y-as zit.
• Voorbeeld: lymfocyten, monocyten, granulocyten.
Fluorescentie
• De verschillende fluorochromen absorberen het laserlicht
(=excitatie/absorptie) en zenden licht uit met een hogere
golflengte (= emissie)
• Kleur (emissiegolflengte) van dit licht is afhankelijk van het
gebruikte fluorochroom.
• Een fluorescente groep wordt aangeslagen met de laser, deze
komt in een hogere energie staat, vervalt en emitteert licht met
ietjes minder energie, de golflengte wordt dus hoger.
• Mate van fluorescentie geeft maat van binding weer, laag en
hoog positief voor de marker
• Strokes shift: het verschil tussen de golflengte van absorptie en emissie
, •
Werking flowcell
• De cellen uit de monsterbuis worden in de mantelstroom geïnjecteerd.
• De stroom in een stroomcel is laminair: je zit in het midden van je sample.
• Het hydrodynamische focussing (concentratie op 1 plek) duwt de cellen om 1
lijn te vormen langs hun lange as (horizontaal)
• De vorm van de flowcel verstrekt de mogelijkheid voor hydrodynamisch
focussing van de cellen.
Werking flowcytometer
• Vloeistofsysteem
o Pomp brengt sheat fluid op druk
o Sheat fluid loopt door een filter
o Sheat fluid gaat door een flowcell
o Eindigt in afval vat
o Injectienaald injecteert in flowcell
o Verdwijnt hierna ook in afval vat
→ Om de cellen in te brengen en te focussen
voor ondervraging
• Hydrodynamic focusing
o In de flowcell is het belangrijk dat de
cellen een voor een door de laserstraal
gaan
o Je hebt een continue stroming van de
sheath vloeistof, je sample wordt daar met een iets hogere druk ingevoerd
o De sheath vloeistof drukt hierdoor de sample samen, omdat deze stromen niet mengen krijg
je laminaire stroming waarin alle cellen oplijnen.
