MBE Meetrapport qPCR
Leerjaar 2 Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek MBE
Doel qPCR
Bij een qPCR kunnen, met behulp van fluorescentie, de qPCR kopieën van DNA worden
gekwantificeerd. De fluorescente stof SYBR-Green intercaleert in het dubbelstrengs DNA tijdens de
polymerisatie. Als het zich tussen de DNA strengen bevindt, neemt de fluorescentie met 1000x toe.
Door het meten van de fluorescentie met het qPCR-apparaat kan worden bepaald hoeveel DNA
kopieën er aanwezig zijn.
Het doel van deze qPCR is om de hoeveelheid virusdeeltjes in een patiëntmonster te detecteren.
Verwachting qPCR
Om het aantal DNA-kopieën goed te kunnen kwantificeren, moet er een standaardcurve worden
opgenomen. Voor onze standaardcurve wordt er een plasmide dat een deel van het virale DNA bevat
gebruikt. Van deze plasmide is de DNA-concentratie bekend (500 ng/µl) en hiermee kan de
hoeveelheid virusdeeltjes/mL worden berekend. Van de standaard zijn eerst 4 verdunningen
gemaakt:
Verdunning 1: 1x10-3 µg/µl
Verdunning 2: 1x10-5 µg/µl
Verdunning 3: 1x10-7 µg/µl
Verdunning 4: 1x10-9 µg/µl
Er wordt ook een mastermix gemaakt met alle componenten die aan de monsters moeten worden
toegevoegd. Er is een mastermix gemaakt voor 8 reacties bestaande uit:
- 80 µl SYBR-Green mix (2x)
- 8 µl Forward primer Virus A (10 µM)
- 8 µl Reverse primer Virus A (10 µM)
- 54 µl H2O
Tabel 1: qPCR input en verwachtingen
Reacti Input (monster) Verwachting *
e
1 (A02) Verdunning 1en mastermix Lage Cq-waarde, want
hoge concentratie
DNA
2 (B02) Verdunning 2 en mastermix Hogere Cq-waarde dan
reactie 1.
3 (C02) Verdunning 3 en mastermix Hogere Cq-waarde dan
reactie 2.
4 (D02) Verdunning 4 en mastermix Hogere Cq-waarde dan
reactie 3.
5 (E02) Onbekende monster en mastermix Geen verwachting, het
is onbekend.
6 (F02) Onbekende monster en mastermix Geen verwachting, het
is onbekend.
7 (G02) MilliQ en mastermix (blanco) Een hoge Cq-waarde,
Negatieve
controle
of geen Cq-waarde.
, * Uitleg:
- Een lage concentratie DNA, geeft een hoge Cq-waarde. Zo geeft een hoge concentratie ook
een lage Cq-waarde.
- Er wordt verwacht dat de Cq-waarden van de 4 verdunningen in ongeveer even grote
stappen toenemen.
- Het resultaat van reactie 7 geeft of een hoge Cq-waarde, omdat er alleen DNA van de
primers uit de mastermix aanwezig is. Deze primers kunnen primer-dimers vormen. Of het
geeft geen Cq-waarde, omdat de hoeveelheid DNA zo minimaal is, dat het niet wordt
gedetecteerd.
De verwachtingen uit tabel 1 zijn schematisch weergegeven in onderstaande afbeelding 1. Hier zijn
de 4 standaardverdunningen te zien. De patiëntmonsters zijn onbekend en hier weten we dus niet
wat voor resultaat het oplevert, deze zijn dan ook niet weergegeven in afbeelding 1. De negatieve
controle is of niet te zien, of zal een hoge Cq-waarde hebben naar verwachting. De tweede optie is
ook weergeven in afbeelding 1.
Afbeelding 1: verwachting resultaat qPCR
Van links naar rechts reactie 1, reactie 2, reactie 3, reactie 4 en reactie 7
Leerjaar 2 Biologie en Medisch Laboratoriumonderzoek MBE
Doel qPCR
Bij een qPCR kunnen, met behulp van fluorescentie, de qPCR kopieën van DNA worden
gekwantificeerd. De fluorescente stof SYBR-Green intercaleert in het dubbelstrengs DNA tijdens de
polymerisatie. Als het zich tussen de DNA strengen bevindt, neemt de fluorescentie met 1000x toe.
Door het meten van de fluorescentie met het qPCR-apparaat kan worden bepaald hoeveel DNA
kopieën er aanwezig zijn.
Het doel van deze qPCR is om de hoeveelheid virusdeeltjes in een patiëntmonster te detecteren.
Verwachting qPCR
Om het aantal DNA-kopieën goed te kunnen kwantificeren, moet er een standaardcurve worden
opgenomen. Voor onze standaardcurve wordt er een plasmide dat een deel van het virale DNA bevat
gebruikt. Van deze plasmide is de DNA-concentratie bekend (500 ng/µl) en hiermee kan de
hoeveelheid virusdeeltjes/mL worden berekend. Van de standaard zijn eerst 4 verdunningen
gemaakt:
Verdunning 1: 1x10-3 µg/µl
Verdunning 2: 1x10-5 µg/µl
Verdunning 3: 1x10-7 µg/µl
Verdunning 4: 1x10-9 µg/µl
Er wordt ook een mastermix gemaakt met alle componenten die aan de monsters moeten worden
toegevoegd. Er is een mastermix gemaakt voor 8 reacties bestaande uit:
- 80 µl SYBR-Green mix (2x)
- 8 µl Forward primer Virus A (10 µM)
- 8 µl Reverse primer Virus A (10 µM)
- 54 µl H2O
Tabel 1: qPCR input en verwachtingen
Reacti Input (monster) Verwachting *
e
1 (A02) Verdunning 1en mastermix Lage Cq-waarde, want
hoge concentratie
DNA
2 (B02) Verdunning 2 en mastermix Hogere Cq-waarde dan
reactie 1.
3 (C02) Verdunning 3 en mastermix Hogere Cq-waarde dan
reactie 2.
4 (D02) Verdunning 4 en mastermix Hogere Cq-waarde dan
reactie 3.
5 (E02) Onbekende monster en mastermix Geen verwachting, het
is onbekend.
6 (F02) Onbekende monster en mastermix Geen verwachting, het
is onbekend.
7 (G02) MilliQ en mastermix (blanco) Een hoge Cq-waarde,
Negatieve
controle
of geen Cq-waarde.
, * Uitleg:
- Een lage concentratie DNA, geeft een hoge Cq-waarde. Zo geeft een hoge concentratie ook
een lage Cq-waarde.
- Er wordt verwacht dat de Cq-waarden van de 4 verdunningen in ongeveer even grote
stappen toenemen.
- Het resultaat van reactie 7 geeft of een hoge Cq-waarde, omdat er alleen DNA van de
primers uit de mastermix aanwezig is. Deze primers kunnen primer-dimers vormen. Of het
geeft geen Cq-waarde, omdat de hoeveelheid DNA zo minimaal is, dat het niet wordt
gedetecteerd.
De verwachtingen uit tabel 1 zijn schematisch weergegeven in onderstaande afbeelding 1. Hier zijn
de 4 standaardverdunningen te zien. De patiëntmonsters zijn onbekend en hier weten we dus niet
wat voor resultaat het oplevert, deze zijn dan ook niet weergegeven in afbeelding 1. De negatieve
controle is of niet te zien, of zal een hoge Cq-waarde hebben naar verwachting. De tweede optie is
ook weergeven in afbeelding 1.
Afbeelding 1: verwachting resultaat qPCR
Van links naar rechts reactie 1, reactie 2, reactie 3, reactie 4 en reactie 7
