Samenvatting - Methoden In Het Biomedisch Onderzoek 1: hoofdstuk 8

Hoofdstuk 8 Bioluminescentie/ Fluorescentie
1.8.1. Inleiding
Men gaat specimen zelf licht laten produceren: zodat men een beter contrast krijgen. Dit is het
tegenovergestelde van met een lichtbron doorheen het specimen schijnen (lichtmicroscopie).
 Hoog contrast (signaal tegen donkere achtergrond).
 Zeer specifiek contrast door gebruik van bv antilichamen.
 Meerkleurige merking => combinatie van verschillende soorten informatie.
 Beeldvorming in levende cellen / in vivo beeldvorming.
 Kwantitatieve beeldvorming (bv sensoren voor Ca-concentratie, pH, ...).
Bioluminescentie en fluorescentie zijn afgeleid van (micro-)organismes en diersoorten die licht
afgeven.
Licht wordt geproduceerd op basis
van een chemische reactie =
Bioluminescentie.




1.8.2 Bioluminescentie
1.8.2.1 Principe
Bioluminescentie gebeurt altijd met een substraat en enzymen (meestal luciferase).

,  Bij de aanwezigheid van zuurstof gebeurt er een oxidatie
van het substraat luciferine (met co-factoren).
=> Oxyluciferine wordt aangemaakt en komt in een
aangeslagen toestand terecht.
=> Terugkeer naar grondtoestand door vrijgave van licht.
=> Er is in zekere mate een oxidatie van luciferine maar
dat is een trage reactie.
=> Daarom hebben we een enzym nodig. Enzym luciferase
wordt gebruikt als katalysator.
 Zeer efficiënt reactie wat betreft lichtopbrengst: bijna alle
energie komt vrij in de vorm van licht tijdens de reactie.
Verschillende luciferine/luciferase combinaties mogelijk
=> bepaalt de kleur van het licht.
Men maakt een onderscheid tussen de land substraten en zee substraten (golflengte is korter dan
land substraten).
Bioluminescentie bij 90% van de diepzeedieren
Zee organismen gaan vaker gebruik maken van bioluminescentie. Het licht kan niet diep in het water
doordringen dus kunnen geen gebruik maken van fluorescentie.
1.8.2.2 In vitro metingen
Reactie van het substraat en enzym:
Vuurvlieg luciferase/luciferin
Drie zaken nodig voor licht:
 Luciferin
 Luciferase
 ATP
=>Lichtintensiteit/lichtopbrengst is afhankelijk van de concentratie van luciferin, luciferase en ATP.
We kunne verschillende tests ontwikkelen:
1. Een test die enkel afhankelijk is van de concentratie Luciferase waarbij en luciferin en ATP
toedient.
2. een test die afhankelijk is van de aanwezigheid van ATP. Luciferin en luciferase worden
beschikbaar gemaakt, dan hangt de reactie af van de concentratie ATP die beschikbaar is.
High Throughput Screening (HTS) assays kunnen gebruik maken van bioluminescentie om de
activiteit van bepaalde enzymen of biologische processen te meten.
Luciferase concentratie
Luciferase wordt gebruikt als een rapporteur gen om de activiteit van specifieke promotors of genen
te meten. Wanneer de promotor of het gen actief wordt, neemt de concentratie van luciferase toe
als gevolg van transcriptie. Daarna wordt luciferine toegevoegd, wat resulteert in lichtproductie die
afhankelijk is van de concentratie luciferase die is opgebouwd door de transcriptie van het
rapporteurgen.

, Dit proces kan worden gebruikt om genexpressie en post-transcriptionele regulatie te meten,
evenals intracellulaire gebeurtenissen die gekoppeld zijn aan genexpressie, zoals receptoractivatie,
signaaltransductie en cellulaire respons bij infectie of therapie.
Luciferine concentratie is niet direct gelinkt aan fysiologische parameter. Gebonden luciferine is niet-
actief.
We kunnen dus een test maken waarbij luciferine wordt vrijgemaakt door specifieke enzymen. Zodat
luciferine vrijkomt voor de reactie waardoor licht wordt geproduceerd. Het specifiek enzymen
bepaalt de concentratie van vrij luciferine
=> Bioluminescent signaal ~ enzymatisch werking.
ATP concentratie
Voor realtime bepaling van ATP gerelateerde activiteit
De bepaling van ATP-gerelateerde activiteit in levende cellen en organismen is een zeer gevoelige en
snelle methode om het celmetabolisme te meten met behulpt van bioluminescentie test assays.
Het kan worden gebruikt voor verschillende toepassingen:
 Het opsporen van bacteriële contaminatie in voedingsmiddelen en de gezondheidszorg,
 Het meten van cytotoxiciteit (waarbij de ATP-concentratie correleert met de cel viabiliteit).
 Het meten van de kinase-activiteit (waarbij de bioluminescentie afneemt naarmate er
minder ATP beschikbaar is voor fosforylering).
1.8.2.3 In vivo metingen
Om de concentratie van tumorcellen in vivo te kunnen meten,
worden specifieke tumorcellen getransfecteerd met het luciferase-
gen als reporter. Na expressie van het luciferase-gen zullen de
tumorcellen deze stof aanmaken, waardoor de concentratie van
luciferase in het lichaam gekwantificeerd en gevisualiseerd kan
worden.
Voor het meten van de luciferase-concentratie in vivo wordt een
dier geïmplanteerd met de tumorcellen. Na verloop van tijd zullen
de tumorcellen luciferase aanmaken. Om het geproduceerde licht te
meten, wordt luciferine toegediend aan het dier, waardoor er licht
wordt opgewekt. Dit licht kan vervolgens worden gemeten met een camera, waarbij een
emissiefilter wordt gebruikt om een specifieke golflengte door te laten.
De tumoren moeten zich vlak onder de huid bevinden, omdat het signaal anders mogelijk niet wordt
opgepikt. Dit komt doordat het licht verstrooid wordt door weefsel: je krijgt een vervaagd beeld en
een deel van het licht wordt geabsorbeerd. Het lichtsignaal is afhankelijk van diepte en intensiteit
van de bron.
Lichtdiffusie/absorptie doorheen weefsel


Optimale venster: licht minder
opgenomen door weefsel.