Les 7
mtDNA analyse
In het mtDNA zien we hypervariabele regio’s, dit zijn de
stukken van het mtDNA met de meeste variatie. We
gebruiken dan ook twee primers om deze regio’s te
amplificeren. Ook zien we in deze hypervariabele regio’s
soms een poly-C regio voorkomen (veel C’s achter elkaar).
Echter, wanneer deze worden onderbroken door een T
(en die weer terug muteert naar een C), kan dit mogelijks
tot problemen leiden voor de sequentie analyse. Bij de
sequentie analyse gaan we natuurlijk kijken wat precies de
sequentie is? Wat zijn de verschillen ten opzichte van de
controle sequentie?
Problemen van de sequentie analyse bij een poly-C
We zien in deze sequentie analyse dat we de sequentie links
van de poly-C goed kunnen aflezen. Maar, wanneer we meer naar rechts gaan, zullen er problemen
ontstaan. Wanneer de poly-C sequentie wordt onderbroken door een T, kunnen we juist een goede
sequentie aflezen. Maar, wanneer deze T terug muteert naar een C, dan gaan we geen sequentie
meer kunnen aflezen. De oorzaak is, dat het DNA-polymerase problemen heeft om het juiste aantal
nucleotiden in te bouwen. Dit resulteert in inserties of in deleties. Het gevolg is dan dat de PCR-
producten uit een mengsel van sequenties bestaan met verschillende lengtes aan poly-nucleotiden
(bijvoorbeeld C7, C8, C9, etc.). Dit noemen we ook wel lengte heteroplasmie. Met andere woorden:
Het polymerase weet even niet meer hoeveel C’s hij moet inbouwen en raakt in de war. Zo ontstaat
er een mengsel van verschillende lengtes,
doordat er een verschillend aantal C’s worden
ingebouwd. Als oplossing gaan we dan een
tweede sequentie primer gebruiken: We kiezen
een sequentie complementair aan het uiteinde
van de poly-C en vanaf hier kunnen we dan de
sequentie gaan bepalen naar de poly-C toe. Naast de forward streng, wordt er ook de reverse streng
geanalyseerd, deze moeten natuurlijk dezelfde (omgekeerde) sequentie geven! We gebruiken twee
keer deze primers op dezelfde plaats, deze moeten dan natuurlijk ook dezelfde sequentie geven!
Echter, dit is een erg arbeidsintensieve methode. Met een beperkt aantal sporen is dit geen
probleem, maar bij veel sporen is dit niet te doen
(denk bijvoorbeeld aan een situatie met tientallen
verdachten). Hoe gaan we al deze sporen
analyseren op een zo kort mogelijke tijd?
Alternatieve analyse voor mtDNA – Array
Er wordt bij een array een strip gebruikt waar
verschillende oligonucleotiden op zitten. Deze
oligonucleotiden zullen een specifiek mtDNA
sequentie detecteren, dit noemen we een lineaire
array. We gebruiken in dit geval een gekend staal
(K) en een spoor (Q, question sample). In dit geval
zien we dat deze duidelijk verschillend zijn. Dus, we
hoeven nu niet op Sanger sequentie over te gaan. Dit is nu een snelle screening van veel biologische
sporen.
Alternatieve analyse voor mtDNA – Klassieke methode, ASO
Pagina 1 van 8
mtDNA analyse
In het mtDNA zien we hypervariabele regio’s, dit zijn de
stukken van het mtDNA met de meeste variatie. We
gebruiken dan ook twee primers om deze regio’s te
amplificeren. Ook zien we in deze hypervariabele regio’s
soms een poly-C regio voorkomen (veel C’s achter elkaar).
Echter, wanneer deze worden onderbroken door een T
(en die weer terug muteert naar een C), kan dit mogelijks
tot problemen leiden voor de sequentie analyse. Bij de
sequentie analyse gaan we natuurlijk kijken wat precies de
sequentie is? Wat zijn de verschillen ten opzichte van de
controle sequentie?
Problemen van de sequentie analyse bij een poly-C
We zien in deze sequentie analyse dat we de sequentie links
van de poly-C goed kunnen aflezen. Maar, wanneer we meer naar rechts gaan, zullen er problemen
ontstaan. Wanneer de poly-C sequentie wordt onderbroken door een T, kunnen we juist een goede
sequentie aflezen. Maar, wanneer deze T terug muteert naar een C, dan gaan we geen sequentie
meer kunnen aflezen. De oorzaak is, dat het DNA-polymerase problemen heeft om het juiste aantal
nucleotiden in te bouwen. Dit resulteert in inserties of in deleties. Het gevolg is dan dat de PCR-
producten uit een mengsel van sequenties bestaan met verschillende lengtes aan poly-nucleotiden
(bijvoorbeeld C7, C8, C9, etc.). Dit noemen we ook wel lengte heteroplasmie. Met andere woorden:
Het polymerase weet even niet meer hoeveel C’s hij moet inbouwen en raakt in de war. Zo ontstaat
er een mengsel van verschillende lengtes,
doordat er een verschillend aantal C’s worden
ingebouwd. Als oplossing gaan we dan een
tweede sequentie primer gebruiken: We kiezen
een sequentie complementair aan het uiteinde
van de poly-C en vanaf hier kunnen we dan de
sequentie gaan bepalen naar de poly-C toe. Naast de forward streng, wordt er ook de reverse streng
geanalyseerd, deze moeten natuurlijk dezelfde (omgekeerde) sequentie geven! We gebruiken twee
keer deze primers op dezelfde plaats, deze moeten dan natuurlijk ook dezelfde sequentie geven!
Echter, dit is een erg arbeidsintensieve methode. Met een beperkt aantal sporen is dit geen
probleem, maar bij veel sporen is dit niet te doen
(denk bijvoorbeeld aan een situatie met tientallen
verdachten). Hoe gaan we al deze sporen
analyseren op een zo kort mogelijke tijd?
Alternatieve analyse voor mtDNA – Array
Er wordt bij een array een strip gebruikt waar
verschillende oligonucleotiden op zitten. Deze
oligonucleotiden zullen een specifiek mtDNA
sequentie detecteren, dit noemen we een lineaire
array. We gebruiken in dit geval een gekend staal
(K) en een spoor (Q, question sample). In dit geval
zien we dat deze duidelijk verschillend zijn. Dus, we
hoeven nu niet op Sanger sequentie over te gaan. Dit is nu een snelle screening van veel biologische
sporen.
Alternatieve analyse voor mtDNA – Klassieke methode, ASO
Pagina 1 van 8
