H1: CYTOGENETICA (CHROMOSOMEN ONDERZOEK)
1. Cytogenetische technieken
Klassieke karyotypering
Karyotype = chromsomenprofiel van een persoon (aantal + vorm)
Karyotypering = visualiseren van de chromosomen
Delende cellen nodig: chromosomen worden enkel zichtbaar tijdens de mitose (condensatie)
Daarom: cellen nodig die delen (indien niet spontaan: mitogeen toevoegen inductie mitose)
Meest gebruikte cellen
o Witte bloedcellen (T-lymfocyten) via bloedafname in een steriel buisje met heparine
(antistollingsmiddel)
o Fibroblasten uit een kleine huidbiopsie bij vermoeden van mozaïcisme
o Maligne cellen type kanker bepalen
o Prenataal: verschillende celtypes
Mitose stilleggen: toevoeging van colchicine bindt aan vrij tubuline delingsspoel breekt af
chromosomen blijven in de metafase in hypotone oplossing chromosomen zwellen & barsten
(zusterchromatiden gaan uit elkaar)
Identificatie van de chromosomen (verschillende criteria)
Grootte: 1 is het grootste 22 is het kleinste (maar na sequentiebepaling bleek dat 22
groter is dan 21 = historische vergissing)
Positie van het centromeer (verhouding van de grootte van de korte p-arm tov de lange q-
arm)
o Chromosoom 1: mediocentrisch
o Chromosoom 13, 14, 15, 21, 22: acrocentrisch zeer kleine p-arm: bevat genen
voor ribosomaal RNA (vormen de nuceloli) + is identiek voor deze chromosomen +
betrokken in de Robertsoniaanse translocatie (chromosoomafwijking)
Banderingspatroon (zichtbaar door kleuring): specifiek voor elk chromosoom & bij elke mens
identiek
o Nummering van elk bandje exacte beschrijving van de lokalisatie van genen &
chromosomale afwijkingen
o G-banding (meest gebruikt): bleek (veel genen: euchromatine) & donker
(minder/geen genen: heterochromatine)
FISH: fluorescentie in situ hybridisatie
doel: gericht de positie van een bepaald chromosoomfragment (target DNA) in het licht stellen
DNA sonde/probe = DNA molecule afkomstig van het chromosoomfragment gemerkt met
een fluorescerende stof
Target DNA & DNA sonde: enkelstrengig gemaakt draagglaasje hybridisatie: DNA sonde
hecht vast op het overeenkomstig chromsoomfragment (in situ)
Fluorescentiemicroscoop: positie van de sonde in het licht stellen
DNA sondes van alle chromosomale regio’s van elk gen door het Humaan Genoom Project
FISH op metafase chromosomen normaal: 2 x 2 signalen (zusterchromatiden)
Interfase FISH: uitvoering op interfase kernen van niet-delende cellen (2 signalen)
Snel resultaat: bv. bij vermoeden van Down syndroom of ambigue genitalia (onduidelijk
geslacht) snelle diagnose
Onderzoek op traag delende cellen: bv. amniocyten
Onderzoek op cellen die (in vitro) niet delen: bv. blastomeren, kankercellen, …
Astrid Vermeire – Genetica
,Toepassingen van FISH:
Opsporen van structurele chromsoomafwijkingen (bv. translocaties)
Opsporen van submicroscopische chromosoom afwijkingen (bv. microdeleties)
o Niet te detecteren met klassieke karyotypering (indien duplicatie/deletie < 5 Mb + is
subjectief: evaluatie ‘op het zicht’)
o Bv. DiGeorge syndroom (neurocristopathie): Microdeletie in chromosoom 22q11
hartafwijking, onderontwikkeling van thymus en bijschildklier, faciale afwijkingen
Chromosomaal Microarray onderzoek: array comparative genome hybridisation (array-CGH)
Doel: afwijkingen in het aantal kopijen van een chromosoom (anaploidie) of chromosoomfragmenten
(CNV’s) opsporen
Vergelijkende hybridisatie: gefragmenteerde DNA van de patiënt (rood) en controle (groen) w
fluorescerend gemerkt mengsel van gelijke hoeveelheden op micro-array hybridisatie
Micro-array = draagglaasje met kleine hoeveelheden van een groot aantal enkelstrengige
DNA-fragmenten (= synthetische oligonucleotiden)
Intensiteit van het groen en rode signaal: gelijk (normale samenstelling van het DNA), sterker
groen (deletie: 1/2), sterker rood (duplicatie: 3/2)
Toepassing: screenen naar submicroscopische afwijking
karyotypering w niet meer uitgevoerd bij kleine chromosomale afwijkingen: te lage resolutie
FISH: gericht op zoek gaan
kracht van array-CGH: objectieve analyse + hoge resolutie + screening van het hele genoom
mogelijk
Wanneer er geen delende cellen beschikbaar zijn (bv. weefsel na miskraam, na overlijden,
bepaalde tumoren, …)
Slechts beperkt aantal cellen beschikbaar (bv. pre-implantatie genetische diagnose)
Beperkingen
(1) Gebalanceerde structurele afwijkingen worden niet gedetecteerd (translocatie/inversie): geen
verlies of toename karyotypering/FISH noodzakelijk (bv. bij vruchtbaarheidproblemen of
herhaalde miskramen)
(2) Normale variatie CNV’s (10% van het genoom/genen) = genen waarbij er heel veel variatie is
in het aantal kopijen in de normale bevolking (frequente of zeldzame/unieke CNV’s)
Pathogeen: causaal voor het fenotype
Beninge: geen effect op het fenotype
Interpretatie van een afwijking op de microarry niet eenvoudig: oorzaak van de aandoening of een
variant zonder betekenis? goede analyse nodig
IN SILICO: databanken
o Databanken met gekende causale afwijkingen gekende pathogene CNV?
o Databanken met gekende varianten in de normale populatie onvolledig: dagelijks
nieuwe zeldzame varianten zonder gevolgen voor de gezondheid
o Grootte van de afwijking: CNV bevat veel genen grote kans dat dit leidt tot een
aandoening (niet absoluut)
o Deleties: vaker de oorzaak van een aandoening dan duplicaties
Ligt er een gekend gen in deze regio en kan dit gen in verband gebracht worden met de
afwijkingen van het kind?
IN VIVO: familieonderzoeken
o Normale ouders geen drager: de novo CNV-mutaties (uitzonderlijk: 1/50) kans dat
de variant de oorzaak is van de aandoening↑
o Aandoening in de familie: segregeert de CNV samen met het fenotype?
Astrid Vermeire – Genetica
, DECIPHER: verzameling van alle genetische en fenotypische informatie over CNV’s, MAAR nog steeds
unclassified variants (VOUS) = CNV’s waarvan de betekenis nog onduidelijk is
(3) Genoom-wijde screening: detectie van toevallige genetische afwijkingen mogelijk (= incidental
findings/ secondary variants)
MLPA = Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (= kwantitatieve DNA analyse dmv PCR)
Doel: bepalen van het aantal kopijen van bepaalde DNA-sequenties (detectie duplicaties/deleties)
Voordelen: (1) goedkoper dan FISH en array-CGH, (2) hoge resolutie (exon-niveau), (3) snel
Nadeel: aantal onderzochte genen is beperkt (maximaal een tiental verschillende loci)
Sequenering: next generation sequenering
= massief parallel sequeneringen van alle exonen (exoom, WES) of het volledige genoom (WGS)
Toegepast in (1) niet-invasieve prenatale testing en (2) preimplantatie genetische diagnose
Welke techniek is geschikt? 2 parameters: resolutie (kleinste afwijking die kan opgespoord
worden?) & screening (hoeveel loci kunnen in één enkele test onderzocht worden)
2. Chromosomale afwijkingen
Classificatie: op verschillende manieren mogelijk
(1) Ontstaansmechanisme
Meiotische fout: foutieve chromosomensegregatie tijdens meiose (bv. vrije trisomie 21)
Postzygotische fout: fout tijdens een gewone celdeling (mitose) mozaïcisme (bv.
mozaïcisme voor trisomie 21)
Fout tijdens bevruchting (bv. triploïdie: bevruchting van één eicel door 2 zaadcellen)
(2) Type afwijking: structureel versus numeriek.
Numerieke afwijkingen: foutief aantal chromosomen
POLYPLOIDIE: bv. triploïdie 69 chromosomen.
ANEUPLOIDIE: een verlies of extra kopij van één of meerdere chromosomen
Monosomie: één chromosoom van een homoloog paar (niet leefbaar, behalve bij Turner
syndroom 1 X chromosoom)
Trisomie: drie exemplaren van een chromosoom
o Autosomale trisomies die niet meteen in een miskraam eindigen: 21 (meest
voorkomend & als enige leefbaar), 18 en 13 ernstige afwijkingen & opgespoord
via NIPT
o Trisomies van de geslachtschromosomen (47,XXX, 47,XYY, 47,XXY): leefbaar &
minder uitgesproken manifestaties.
Astrid Vermeire – Genetica
, Structurele afwijkingen meest voorkomende:
deletie (partiële monosomie): stuk van een chromosoom tekort
duplicatie (partiële trisomie): stuk van een chromosoom teveel
translocatie: (stuk van) een chromosoom verplaatst
inversie: stuk van een chromosoom is geïnverteerd of omgekeerd.
Miskramen: grootste deel van de bevruchte eicellen ontwikkelt niet verder (voor de zwangerschap
opgemerkt w of in het eerste trimester)
Oorzaak: meestal door chromosomale afwijkingen (belangrijkste doodsoorzaak bij de mens vanaf
bevruchting)
Pre-implantatie periode: verlies van 1/3 van de embryo’s
na de bevruchting: aantal cruciale stappen waar er veel kan mislopen
Ontwikkeling 1ste dagen afhankelijk van mRNA en eiwitten in de eicel
Activering van het embryonale genoom (vanaf het +/- 4-8 cellen stadium)
Chromosomale afwijkingen vanaf de activering: nadelige effecten afsterven van de
vrucht voor de implantatie
Post-implantatie: verlies van 1/3 van de embryo’s/foetussen (voor 6 weken PML: 25%, erna: 10%)
Tgv een aantal frequente chromosomale afwijkingen
Triploïdie & trisomie 16 miskraam
Trisomie & monosomie X (Turner) groot gedeelte: miskraam, MAAR door onvolledige
prenatale selectie: geboorte mogelijk
**late implantatie kan een eerste teken zijn van een chromosomale afwijking (leidt tot miskraam)
Na de geboorte: > 3% heeft een aangeboren aandoening
1/200: grote (cytogenetisch zichtbare) chromosomale afwijking & 1/600: relevant CNV
IVF: toedienen van hormonen meerdere rijpe eicellen opgepikt & bevrucht met zaadcellen
(ICSI) D3: blastomeer D5: blastocyst 2/8: overleeft in de baarmoeder
Slaagpercentage: 20-25% (beperkt door chromosomale afwijkingen) testen om dit te verbeteren:
(1) PRE-IMPLANTATIE GENETISCHE TESTING VOOR ANAPLOIDIE (PGT-A)
= alle chromosomale aneuploïdies opsporen adhv interfase FISH, microarray en NGS op een 8-cellen
blastomeer (3 dagen)
MAAR: uit studies blijkt dat het niet leidt tot betere resultaten verklaring: genetisch mozaïcisme
(90%: min. 1 cel met een chromosomale afwijking door fouten tijdens mitose in de 1 ste celdelingen)
Nog geen activering van het embryonaal genoom nog geen selectie tegen deze
afwijkingen: gebeurt pas na de activering w gevolgd door de differentiatie van het embryo
Vele van die embryo’s: normale ontwikkeling (25%) mogelijke verklaringen: (1) uitselectie
van de mutaties (embryo ontwikkelt uit de normale cellen) en (2) foutieve cellen komen
terecht in weefsels waar ze minder nadelige gevolgen hebben (bv. placenta)
Genetisch onderzoek van 1 blastomeer: vaak niet representatief voor de genetische kwaliteit van het
hele embryo = PGT-A werkt niet op dag 3
(2) PRE-IMPLANTATIE MORFOLOGISCHE SCREENING
Vrucht langer in vitro kweken (tot D5: bastocyst) selectie van vruchtjes: adhv morfologische
criteria de embryo’s met betere overlevingskansen onderscheiden
Bijkomende PGT-A: verbetert de selectie (trofoblast biopsie van 5- tal trofoblastcellen)
MAAR: langere artificiële kweek kan nadelige epigenetische effecten hebben op het embryo
Onderzoek hiernaar is nog lopende & trofoblast is niet steeds representatief voor embryoblast
Astrid Vermeire – Genetica
1. Cytogenetische technieken
Klassieke karyotypering
Karyotype = chromsomenprofiel van een persoon (aantal + vorm)
Karyotypering = visualiseren van de chromosomen
Delende cellen nodig: chromosomen worden enkel zichtbaar tijdens de mitose (condensatie)
Daarom: cellen nodig die delen (indien niet spontaan: mitogeen toevoegen inductie mitose)
Meest gebruikte cellen
o Witte bloedcellen (T-lymfocyten) via bloedafname in een steriel buisje met heparine
(antistollingsmiddel)
o Fibroblasten uit een kleine huidbiopsie bij vermoeden van mozaïcisme
o Maligne cellen type kanker bepalen
o Prenataal: verschillende celtypes
Mitose stilleggen: toevoeging van colchicine bindt aan vrij tubuline delingsspoel breekt af
chromosomen blijven in de metafase in hypotone oplossing chromosomen zwellen & barsten
(zusterchromatiden gaan uit elkaar)
Identificatie van de chromosomen (verschillende criteria)
Grootte: 1 is het grootste 22 is het kleinste (maar na sequentiebepaling bleek dat 22
groter is dan 21 = historische vergissing)
Positie van het centromeer (verhouding van de grootte van de korte p-arm tov de lange q-
arm)
o Chromosoom 1: mediocentrisch
o Chromosoom 13, 14, 15, 21, 22: acrocentrisch zeer kleine p-arm: bevat genen
voor ribosomaal RNA (vormen de nuceloli) + is identiek voor deze chromosomen +
betrokken in de Robertsoniaanse translocatie (chromosoomafwijking)
Banderingspatroon (zichtbaar door kleuring): specifiek voor elk chromosoom & bij elke mens
identiek
o Nummering van elk bandje exacte beschrijving van de lokalisatie van genen &
chromosomale afwijkingen
o G-banding (meest gebruikt): bleek (veel genen: euchromatine) & donker
(minder/geen genen: heterochromatine)
FISH: fluorescentie in situ hybridisatie
doel: gericht de positie van een bepaald chromosoomfragment (target DNA) in het licht stellen
DNA sonde/probe = DNA molecule afkomstig van het chromosoomfragment gemerkt met
een fluorescerende stof
Target DNA & DNA sonde: enkelstrengig gemaakt draagglaasje hybridisatie: DNA sonde
hecht vast op het overeenkomstig chromsoomfragment (in situ)
Fluorescentiemicroscoop: positie van de sonde in het licht stellen
DNA sondes van alle chromosomale regio’s van elk gen door het Humaan Genoom Project
FISH op metafase chromosomen normaal: 2 x 2 signalen (zusterchromatiden)
Interfase FISH: uitvoering op interfase kernen van niet-delende cellen (2 signalen)
Snel resultaat: bv. bij vermoeden van Down syndroom of ambigue genitalia (onduidelijk
geslacht) snelle diagnose
Onderzoek op traag delende cellen: bv. amniocyten
Onderzoek op cellen die (in vitro) niet delen: bv. blastomeren, kankercellen, …
Astrid Vermeire – Genetica
,Toepassingen van FISH:
Opsporen van structurele chromsoomafwijkingen (bv. translocaties)
Opsporen van submicroscopische chromosoom afwijkingen (bv. microdeleties)
o Niet te detecteren met klassieke karyotypering (indien duplicatie/deletie < 5 Mb + is
subjectief: evaluatie ‘op het zicht’)
o Bv. DiGeorge syndroom (neurocristopathie): Microdeletie in chromosoom 22q11
hartafwijking, onderontwikkeling van thymus en bijschildklier, faciale afwijkingen
Chromosomaal Microarray onderzoek: array comparative genome hybridisation (array-CGH)
Doel: afwijkingen in het aantal kopijen van een chromosoom (anaploidie) of chromosoomfragmenten
(CNV’s) opsporen
Vergelijkende hybridisatie: gefragmenteerde DNA van de patiënt (rood) en controle (groen) w
fluorescerend gemerkt mengsel van gelijke hoeveelheden op micro-array hybridisatie
Micro-array = draagglaasje met kleine hoeveelheden van een groot aantal enkelstrengige
DNA-fragmenten (= synthetische oligonucleotiden)
Intensiteit van het groen en rode signaal: gelijk (normale samenstelling van het DNA), sterker
groen (deletie: 1/2), sterker rood (duplicatie: 3/2)
Toepassing: screenen naar submicroscopische afwijking
karyotypering w niet meer uitgevoerd bij kleine chromosomale afwijkingen: te lage resolutie
FISH: gericht op zoek gaan
kracht van array-CGH: objectieve analyse + hoge resolutie + screening van het hele genoom
mogelijk
Wanneer er geen delende cellen beschikbaar zijn (bv. weefsel na miskraam, na overlijden,
bepaalde tumoren, …)
Slechts beperkt aantal cellen beschikbaar (bv. pre-implantatie genetische diagnose)
Beperkingen
(1) Gebalanceerde structurele afwijkingen worden niet gedetecteerd (translocatie/inversie): geen
verlies of toename karyotypering/FISH noodzakelijk (bv. bij vruchtbaarheidproblemen of
herhaalde miskramen)
(2) Normale variatie CNV’s (10% van het genoom/genen) = genen waarbij er heel veel variatie is
in het aantal kopijen in de normale bevolking (frequente of zeldzame/unieke CNV’s)
Pathogeen: causaal voor het fenotype
Beninge: geen effect op het fenotype
Interpretatie van een afwijking op de microarry niet eenvoudig: oorzaak van de aandoening of een
variant zonder betekenis? goede analyse nodig
IN SILICO: databanken
o Databanken met gekende causale afwijkingen gekende pathogene CNV?
o Databanken met gekende varianten in de normale populatie onvolledig: dagelijks
nieuwe zeldzame varianten zonder gevolgen voor de gezondheid
o Grootte van de afwijking: CNV bevat veel genen grote kans dat dit leidt tot een
aandoening (niet absoluut)
o Deleties: vaker de oorzaak van een aandoening dan duplicaties
Ligt er een gekend gen in deze regio en kan dit gen in verband gebracht worden met de
afwijkingen van het kind?
IN VIVO: familieonderzoeken
o Normale ouders geen drager: de novo CNV-mutaties (uitzonderlijk: 1/50) kans dat
de variant de oorzaak is van de aandoening↑
o Aandoening in de familie: segregeert de CNV samen met het fenotype?
Astrid Vermeire – Genetica
, DECIPHER: verzameling van alle genetische en fenotypische informatie over CNV’s, MAAR nog steeds
unclassified variants (VOUS) = CNV’s waarvan de betekenis nog onduidelijk is
(3) Genoom-wijde screening: detectie van toevallige genetische afwijkingen mogelijk (= incidental
findings/ secondary variants)
MLPA = Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (= kwantitatieve DNA analyse dmv PCR)
Doel: bepalen van het aantal kopijen van bepaalde DNA-sequenties (detectie duplicaties/deleties)
Voordelen: (1) goedkoper dan FISH en array-CGH, (2) hoge resolutie (exon-niveau), (3) snel
Nadeel: aantal onderzochte genen is beperkt (maximaal een tiental verschillende loci)
Sequenering: next generation sequenering
= massief parallel sequeneringen van alle exonen (exoom, WES) of het volledige genoom (WGS)
Toegepast in (1) niet-invasieve prenatale testing en (2) preimplantatie genetische diagnose
Welke techniek is geschikt? 2 parameters: resolutie (kleinste afwijking die kan opgespoord
worden?) & screening (hoeveel loci kunnen in één enkele test onderzocht worden)
2. Chromosomale afwijkingen
Classificatie: op verschillende manieren mogelijk
(1) Ontstaansmechanisme
Meiotische fout: foutieve chromosomensegregatie tijdens meiose (bv. vrije trisomie 21)
Postzygotische fout: fout tijdens een gewone celdeling (mitose) mozaïcisme (bv.
mozaïcisme voor trisomie 21)
Fout tijdens bevruchting (bv. triploïdie: bevruchting van één eicel door 2 zaadcellen)
(2) Type afwijking: structureel versus numeriek.
Numerieke afwijkingen: foutief aantal chromosomen
POLYPLOIDIE: bv. triploïdie 69 chromosomen.
ANEUPLOIDIE: een verlies of extra kopij van één of meerdere chromosomen
Monosomie: één chromosoom van een homoloog paar (niet leefbaar, behalve bij Turner
syndroom 1 X chromosoom)
Trisomie: drie exemplaren van een chromosoom
o Autosomale trisomies die niet meteen in een miskraam eindigen: 21 (meest
voorkomend & als enige leefbaar), 18 en 13 ernstige afwijkingen & opgespoord
via NIPT
o Trisomies van de geslachtschromosomen (47,XXX, 47,XYY, 47,XXY): leefbaar &
minder uitgesproken manifestaties.
Astrid Vermeire – Genetica
, Structurele afwijkingen meest voorkomende:
deletie (partiële monosomie): stuk van een chromosoom tekort
duplicatie (partiële trisomie): stuk van een chromosoom teveel
translocatie: (stuk van) een chromosoom verplaatst
inversie: stuk van een chromosoom is geïnverteerd of omgekeerd.
Miskramen: grootste deel van de bevruchte eicellen ontwikkelt niet verder (voor de zwangerschap
opgemerkt w of in het eerste trimester)
Oorzaak: meestal door chromosomale afwijkingen (belangrijkste doodsoorzaak bij de mens vanaf
bevruchting)
Pre-implantatie periode: verlies van 1/3 van de embryo’s
na de bevruchting: aantal cruciale stappen waar er veel kan mislopen
Ontwikkeling 1ste dagen afhankelijk van mRNA en eiwitten in de eicel
Activering van het embryonale genoom (vanaf het +/- 4-8 cellen stadium)
Chromosomale afwijkingen vanaf de activering: nadelige effecten afsterven van de
vrucht voor de implantatie
Post-implantatie: verlies van 1/3 van de embryo’s/foetussen (voor 6 weken PML: 25%, erna: 10%)
Tgv een aantal frequente chromosomale afwijkingen
Triploïdie & trisomie 16 miskraam
Trisomie & monosomie X (Turner) groot gedeelte: miskraam, MAAR door onvolledige
prenatale selectie: geboorte mogelijk
**late implantatie kan een eerste teken zijn van een chromosomale afwijking (leidt tot miskraam)
Na de geboorte: > 3% heeft een aangeboren aandoening
1/200: grote (cytogenetisch zichtbare) chromosomale afwijking & 1/600: relevant CNV
IVF: toedienen van hormonen meerdere rijpe eicellen opgepikt & bevrucht met zaadcellen
(ICSI) D3: blastomeer D5: blastocyst 2/8: overleeft in de baarmoeder
Slaagpercentage: 20-25% (beperkt door chromosomale afwijkingen) testen om dit te verbeteren:
(1) PRE-IMPLANTATIE GENETISCHE TESTING VOOR ANAPLOIDIE (PGT-A)
= alle chromosomale aneuploïdies opsporen adhv interfase FISH, microarray en NGS op een 8-cellen
blastomeer (3 dagen)
MAAR: uit studies blijkt dat het niet leidt tot betere resultaten verklaring: genetisch mozaïcisme
(90%: min. 1 cel met een chromosomale afwijking door fouten tijdens mitose in de 1 ste celdelingen)
Nog geen activering van het embryonaal genoom nog geen selectie tegen deze
afwijkingen: gebeurt pas na de activering w gevolgd door de differentiatie van het embryo
Vele van die embryo’s: normale ontwikkeling (25%) mogelijke verklaringen: (1) uitselectie
van de mutaties (embryo ontwikkelt uit de normale cellen) en (2) foutieve cellen komen
terecht in weefsels waar ze minder nadelige gevolgen hebben (bv. placenta)
Genetisch onderzoek van 1 blastomeer: vaak niet representatief voor de genetische kwaliteit van het
hele embryo = PGT-A werkt niet op dag 3
(2) PRE-IMPLANTATIE MORFOLOGISCHE SCREENING
Vrucht langer in vitro kweken (tot D5: bastocyst) selectie van vruchtjes: adhv morfologische
criteria de embryo’s met betere overlevingskansen onderscheiden
Bijkomende PGT-A: verbetert de selectie (trofoblast biopsie van 5- tal trofoblastcellen)
MAAR: langere artificiële kweek kan nadelige epigenetische effecten hebben op het embryo
Onderzoek hiernaar is nog lopende & trofoblast is niet steeds representatief voor embryoblast
Astrid Vermeire – Genetica
