Hoofdstuk 6: Core DNA technologies
Cloning DNA in bacterial cells
● Cel-gebaseerde klonering
○ Complex DNA-staal wordt in kleine stukjes verdeeld van werkbare grootte
vervolgens worden vectoren/genetisch gemodificeerde plasmiden en
gastheercellen worden gebruikt om DNA mengsel te fractioneren,
vermenigvuldigen en analyseren.
■ Transformatie van stukjes DNA,
via bv. elektroporatie = worden
elk afzonderlijk in cellen
(proces is dus selectief)
gebracht, vaak in snel delende cellen, bv. E. Coli
● Afzonderlijke cellen isoleren en cultiveren ⇒ DNA-opzuiveren
○ Vector
■ Bevat replicon-molecule dat er voor zorgt dat de DNA-sequentie kan
repliceren in de gastheer
■ Sommigen kunnen in een bacteriecel repliceren om hoge
kopie-aantallen te bereiken + bacterie die gekloond DNA bevat deelt
snel ⇒ groot aantal identieke bacterieklonen met elke vele vectoren
met vreemd DNA
■ Plasmiden als vector
● Niet essentiële DNA-moleculen die onafhankelijk van het
gastheerchromosoom repliceren
● Integreren niet in chromosoom gastheer = extrachromosomaal
● Meestal circulair
● Verschillenden kunnen naast elkaar bestaan
● Episomen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Bacteriofaag als vector
● Bestaan extracellulair maar hebben gastheer nodig om te
reproduceren ⇒ besmetting en lysis
● DNA/RNA genoom ingepakt in proteïne mantel
● Profagen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Genetisch gemodificatie is nodig, zodat we efficiënt een vreemd DNA
eraan kunnen verbinden en zodat getransformeerde cellen
gemakkelijker herkend worden
1
, Plaatsen van DNA stukje in vector
Gebruik van type 2 restrictie-nucleasen ⇒ knippen
DNA op plaatsen waar ze specifieke palindromen
(van 5 naar 3 leest hetzelfde als van 3 naar 5)
herkennen + zorgen voor uniforme uiteinden ⇒ kan
overhang (zie afbeelding, voordeel: ‘sticky ends’ =
door basenparing kunnen deze gemakkelijk opnieuw
verbonden worden door DNA-ligase ) of blunt zijn
● Natuurlijk doel = bacteriën beschermen tegen ziekteverwekkers, bv. bacteriofagen
● Plasmidevectoren bevatten klonering sites PL = opeenvolging van
restrictie-herkenningssequenties waar verschillende types nucleasen kunnen gaan
knippen ⇒ waar er geknipt is kan nu gemakkelijk een humaan stukje DNA gebracht
worden
○ Komen ook natuurlijk voor ⇒ natuurlijk doel
○ Bv. pUC19 ⇒ PL zit tussen LacI (repressor van Lacz’) en LacZ’, mechanisme om
te bepalen of er nu een humaan DNA stukje is opgenomen of niet
■ Werking:
- Bij toevoeging van IPTG aan non-recombinant DNA wordt LacI
geïnhibeerd en kan Lacz’ tot expressie komen ⇒ translatie tot
actief bèta-galactosidase ⇒ wanneer men dan X-gal toevoegt
aan de voedingsbodem, kleuren deze cellen blauw
- Recombinant DNA leidt niet tot expressie van Lacz’ ⇒ in
frame: te groot alfa-fragment waardoor inactief
bèta-galatosidase OF niet in frame waardoor ook inactief
Transformatie en fysiek scheiden van celkolonies
Op vector wordt antibioticum-resistentie gen geplaatst + transformatie in cellen die gevoelig
zijn voor antibioticum ⇒ cellen cultiveren op voedingsbodem met antibioticum waardoor
enkel de cellen met het recombinant DNA overleven. BELANGRIJK: mengsel goed
uitspreiden op petrischaal zodat kolonies, 1 kolonie groeit vanuit 1 cel elke cel heeft ander
ander DNA-fragment) goed verspreid zijn en dus makkelijk pikbaar zijn. Nu kan men uit
verschillende kolonies verschillende stukjes DNA opzuiveren.
⇒ Toepassingen
Aanmaak van genomische DNA-kloonbibliotheken
- Bevat verschillende DNA-klonen die tezamen alle verschillende DNA-sequenties in
het genoom omvatten.
2
Cloning DNA in bacterial cells
● Cel-gebaseerde klonering
○ Complex DNA-staal wordt in kleine stukjes verdeeld van werkbare grootte
vervolgens worden vectoren/genetisch gemodificeerde plasmiden en
gastheercellen worden gebruikt om DNA mengsel te fractioneren,
vermenigvuldigen en analyseren.
■ Transformatie van stukjes DNA,
via bv. elektroporatie = worden
elk afzonderlijk in cellen
(proces is dus selectief)
gebracht, vaak in snel delende cellen, bv. E. Coli
● Afzonderlijke cellen isoleren en cultiveren ⇒ DNA-opzuiveren
○ Vector
■ Bevat replicon-molecule dat er voor zorgt dat de DNA-sequentie kan
repliceren in de gastheer
■ Sommigen kunnen in een bacteriecel repliceren om hoge
kopie-aantallen te bereiken + bacterie die gekloond DNA bevat deelt
snel ⇒ groot aantal identieke bacterieklonen met elke vele vectoren
met vreemd DNA
■ Plasmiden als vector
● Niet essentiële DNA-moleculen die onafhankelijk van het
gastheerchromosoom repliceren
● Integreren niet in chromosoom gastheer = extrachromosomaal
● Meestal circulair
● Verschillenden kunnen naast elkaar bestaan
● Episomen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Bacteriofaag als vector
● Bestaan extracellulair maar hebben gastheer nodig om te
reproduceren ⇒ besmetting en lysis
● DNA/RNA genoom ingepakt in proteïne mantel
● Profagen = integreren in chromosoom bacterie of
extrachromosomaal
■ Genetisch gemodificatie is nodig, zodat we efficiënt een vreemd DNA
eraan kunnen verbinden en zodat getransformeerde cellen
gemakkelijker herkend worden
1
, Plaatsen van DNA stukje in vector
Gebruik van type 2 restrictie-nucleasen ⇒ knippen
DNA op plaatsen waar ze specifieke palindromen
(van 5 naar 3 leest hetzelfde als van 3 naar 5)
herkennen + zorgen voor uniforme uiteinden ⇒ kan
overhang (zie afbeelding, voordeel: ‘sticky ends’ =
door basenparing kunnen deze gemakkelijk opnieuw
verbonden worden door DNA-ligase ) of blunt zijn
● Natuurlijk doel = bacteriën beschermen tegen ziekteverwekkers, bv. bacteriofagen
● Plasmidevectoren bevatten klonering sites PL = opeenvolging van
restrictie-herkenningssequenties waar verschillende types nucleasen kunnen gaan
knippen ⇒ waar er geknipt is kan nu gemakkelijk een humaan stukje DNA gebracht
worden
○ Komen ook natuurlijk voor ⇒ natuurlijk doel
○ Bv. pUC19 ⇒ PL zit tussen LacI (repressor van Lacz’) en LacZ’, mechanisme om
te bepalen of er nu een humaan DNA stukje is opgenomen of niet
■ Werking:
- Bij toevoeging van IPTG aan non-recombinant DNA wordt LacI
geïnhibeerd en kan Lacz’ tot expressie komen ⇒ translatie tot
actief bèta-galactosidase ⇒ wanneer men dan X-gal toevoegt
aan de voedingsbodem, kleuren deze cellen blauw
- Recombinant DNA leidt niet tot expressie van Lacz’ ⇒ in
frame: te groot alfa-fragment waardoor inactief
bèta-galatosidase OF niet in frame waardoor ook inactief
Transformatie en fysiek scheiden van celkolonies
Op vector wordt antibioticum-resistentie gen geplaatst + transformatie in cellen die gevoelig
zijn voor antibioticum ⇒ cellen cultiveren op voedingsbodem met antibioticum waardoor
enkel de cellen met het recombinant DNA overleven. BELANGRIJK: mengsel goed
uitspreiden op petrischaal zodat kolonies, 1 kolonie groeit vanuit 1 cel elke cel heeft ander
ander DNA-fragment) goed verspreid zijn en dus makkelijk pikbaar zijn. Nu kan men uit
verschillende kolonies verschillende stukjes DNA opzuiveren.
⇒ Toepassingen
Aanmaak van genomische DNA-kloonbibliotheken
- Bevat verschillende DNA-klonen die tezamen alle verschillende DNA-sequenties in
het genoom omvatten.
2
