Methoden 2 in het biomedisch onderzoek
Inhoudsopgave
1. Inleiding ....................................................................................................................................................... 2
2. Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek ................................................................................... 2
3. Analyse van RNA .......................................................................................................................................... 2
4. Eiwitten ........................................................................................................................................................ 2
4.1 Isoleren van eiwitten .................................................................................................................................... 2
4.2 Aanmaken van eiwitten ................................................................................................................................ 3
4.2.1 Chemische synthese in vitro ................................................................................................................. 3
4.2.2 Enzymatische synthese in vitro ............................................................................................................ 3
4.2.3 In vivo expressie systemen ................................................................................................................... 4
4.2.4 Bereiding van antistoffen ................................................................................................................... 10
4.3 Concentreren van eiwitten ......................................................................................................................... 14
4.3.1 UV absorptie ....................................................................................................................................... 14
4.3.2 Colorimetrische methoden ................................................................................................................. 15
4.3.3 Fluorimetrische methoden ................................................................................................................. 18
4.4 Kwantificeren en identificeren van specifieke eiwitten .............................................................................. 19
4.4.1 Uitzouten ............................................................................................................................................ 19
4.4.2 Centrifugale filters .............................................................................................................................. 20
4.4.3 Chromatografie (zie Methoden I Hfdst 1.10) ..................................................................................... 20
4.5 Kwantificeren en identificeren van specifieke eiwitten .............................................................................. 21
4.5.1 Western blotting (zie vorig jaar Hfdst 1.11) ....................................................................................... 21
4.5.2 Antilichaam micro-arrays (= membraan) ............................................................................................ 21
4.5.3 Flow cytometrie .................................................................................................................................. 22
4.5.4 ELISA ................................................................................................................................................... 24
4.5.5 RIA....................................................................................................................................................... 26
4.5.6 Immunohistochemie ........................................................................................................................... 27
5. Microscopie ................................................................................................................................................ 30
5.1 Fluorescentiemicroscopie ........................................................................................................................... 30
5.1.1 Inleiding .............................................................................................................................................. 30
5.1.2 Confocale microscopie (LSCM/SDCM) ................................................................................................ 32
5.1.3 Light sheet fluorescentie microscopie (LFSM) .................................................................................... 35
5.1.4 2-foton fluorescentie microscopie ..................................................................................................... 38
5.1.5 Total internal reflection fluorescentie microscopy (TIRFM) ............................................................... 40
5.1.6 Samengevat ........................................................................................................................................ 41
5.2 Beeldanalyse ............................................................................................................................................... 41
5.2.1 Beeldopname...................................................................................................................................... 42
5.2.2 Beeldbewerkingen .............................................................................................................................. 44
5.2.3 Samengevat ........................................................................................................................................ 46
5.3 Superresolutie microscopie ......................................................................................................................... 46
5.3.1 Inleiding .............................................................................................................................................. 46
5.3.2 Structured illumination microscopie (SIM) ......................................................................................... 47
5.3.3 Single molecule localization microscopie (SMLM-PALM/STORM) ..................................................... 50
5.3.4 Stimulated emission depletion microscopie (STED) ........................................................................... 56
5.3.5 Samengevat ........................................................................................................................................ 60
1
, 5.4 Elektronenmicroscopie (EM) ....................................................................................................................... 60
5.4.1 Inleiding .............................................................................................................................................. 61
5.4.2 Transmissie elektronen microscopie (TEM)........................................................................................ 64
5.4.3 Scanning elektronen microscopie (SEM) ............................................................................................ 71
5.4.4 Enkele voorbeelden ............................................................................................................................ 72
5.4.5 Aanvullende EM toepassingen ........................................................................................................... 72
5.4.6 Samengevat ........................................................................................................................................ 73
5.5 Scanning probe microscopie (SPM) ............................................................................................................ 74
5.5.1 Near-field scanning optical microscopy (NSOM) ................................................................................ 74
5.5.2 Tunneling microscopy (SPM) .................................................................. Error! Bookmark not defined.
5.5.3 Atomic force microscopy (AFM) ......................................................................................................... 75
5.5.4 Samengevat ........................................................................................................................................ 78
1. Inleiding
2. Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
3. Analyse van RNA
4. Eiwitten
4.1 Isoleren van eiwitten
Homogenisatiebuffer:
- Buffer voor pH (bv Tris)
- Zout zodat eiwitten niet denatureren (bv NaCl)
- Protease inhibitoren zodat eiwitten niet afgebroken worden
o Proteasen = enzymen die eiwitten afbreken = katalyseren afbraak
peptidebindingen tussen AZ
▪ Serine protease (trypsine, thrombonine,…) → geïnhibeerd met PMSF,
Benzamidine, Aprotinine
▪ Metaloproteasen → EDTA
▪ Cysteïne proteasen → leupeptine
▪ Aspartaat proteasen → Pepstatine
o → meestal mengsel van meerdere inhibitoren (met of zonder EDTA)
- Eventueel fosfatase inhibitoren zodat fosforylaties geconserveerd blijven
o Fosfatasen = enzymen die zorgen voor defosforylatie: het weghalen van
fosfaatgroep van een ander molecule (meestal eiwit of metaboliet).
Fosfatasen zijn de tegenhangers van kinasen, die zorgen voor de toevoeging
van een fosfaatgroep aan een molecule.
▪ Serine/threonine fosfatasen → geïnhibeerd door Natrium fluoride of
pyrofosfaat, bèta-glycerofosfaat
▪ Tyrosine fosfatase → natrium orthovanadaat
o → meestal mengsel van meerdere
- Eventueel detergent voor oplossen celmembraan en voor eiwitten die niet goed
oplossen in waterige homogenisatiebuffer
- Eventueel reducerend agens om disulfidebruggen te breken
2
, ➔ Na bekomen ruw eiwitlysaat → verder opzuiveren/scheiden van eiwitten via
verschillende technieken (chromatografie, elektroforese,…)
4.2 Aanmaken van eiwitten
4.2.1 Chemische synthese in vitro
Voordelen:
- Synthese van ‘artificiële’ eiwitten = aminozuren inbouwen die niet in de natuur
voorkomen (activiteit en stabiliteit van de eiwitten neemt zo toe).
- Geen problemen met toxiciteit voor het organisme dat het eiwit moet aanmaken of
met beperkte aminozuurbeschikbaarheid in dat organisme
Nadelen:
- Koppelingsefficiëntie per cyclus 99%
=> opbrengst verlaagt bij elk extra AZ
=> enkel korte sequenties (max 50 AZ) => chemische synthese van langere eiwitten
mogelijk door koppelen van grotere peptiden
- Duur
- Relatief kleine hoeveelheden
Toepassingen:
- Aanmaak peptiden voor antistofproductie
- Aanmaak artificiële eiwitten
- ....
4.2.2 Enzymatische synthese in vitro
• in vitro translatie van RNA in konijnen
reticulocyte (= voorlopercel van een rode bloedcel. Dit zijn zeer gespecialiseerde cellen in
productie van hemoglobine die geen celkern meer hebben en die een zeer krachtige eiwit
translatie machinerie bevatten om hemoglobine te maken.) lysaat of tarwekiem (wheat
germ) extract
- bevat ribosomen
- bevat aminozuren en energie
• Vaak gekoppeld aan in vitro transcriptie (zie 2.3-27)
=> in vitro transcriptie-translatie
(zie figuur 2 reacties,
soms zelfs 1 reactie)
3
,=> Het eiwit is aangemaakt na het toevoegen van DNA (zie + DNA)
4.2.3 In vivo expressie systemen
Meestal expressie van een recombinant eiwit na introductie recombinant DNA (zie
hoofdstuk 1.13)
=> ‘Recombinante eiwitproductie’
➔ Gekozen organisme voor in vivo expressie bepaalt keuze expressie plasmide en
eiwitcoderende sequentie (codon optimisatie!). Codon optimisatie = aanpassen van
eiwit coderende DNA-sequentie naargelang organisme om hogere eiwitexpressie te
krijgen → synonieme codons gebruiken waarvan veel tRNA beschikbaar zijn in
gebruikte organisme/celtype
Er bestaat een genetische gedegenereerde code omdat meerdere codons coderen voor 1
aminozuur. Het is belangrijk dat je de DNA-sequentie gaat aanpassen aan het
modelorganisme om de efficiëntie van de translatie te verhogen.
A. Transiënte eiwitproductie over enkele dagen
(Transfectie van DNA: geen integratie van recombinant DNA in genoom expressie
organisme) => Transfectie en transductie komen in detail aan bod aan methoden 3. Dit zijn
methoden om recombinant DNA in cellen binnen te brengen. Bij transfectie integreert het
DNA niet in het genoom van de gastcel; bij transductie is er wel integratie in het genoom van
de gastcel.
4
, B. Stabiele eiwitproductie over maanden
(Transductie van DNA: integratie recombinant DNA in genoom expressie organisme)
A) Productie op laboratoriumschaal: relatief kleine volumes
B) Productie op industriële schaal: opschaling naar bioreactor productietank
Bacterieel
Voorbeelden:
• Escherichia coli (E. coli) (vaak BL21)
▪ Nadelen: Je moet E.Coli lyseren om het eiwit eruit te halen
▪ Voordelen: Weinig protease activiteit => Weinig eiwit degradatie (eiwit blijft
intact)
• Meer recent: Bacillus subtilis
-> capaciteit tot eiwitsecretie in het medium
• Nadelen bacteriële systemen:
- een juiste post-translationele modificaties (PTMs)
- eiwitten vaak slecht gevouwen en slecht oplosbaar
=> aggregatie in inclusion bodies
5
, • Voordelen:
- gemakkelijk te manipuleren en snel op te schalen
- goedkope cultuurmedia
- induceerbare promotoren: IPTG is een allolactose analoog dat de lac
repressor bindt en inactiveert => transcriptie target gen en translatie eiwit.
Achtergrondinformatie: Lac I codeert voor de Lac repressor => zolang de
repressor aanwezig is heb je geen transcriptie of translatie. Als je dan IPTG
toevoegt gaat het binden op de repressor, waardoor die loskomt en dan kan
RNA polymerase binden.
- inclusion bodies:
▪ geen last van toxiciteit voor de bacterie
▪ beschermd van proteolyse
▪ bevatten relatief zuiver en hoog geconcentreerd eiwit (refolding wel
lastig)
Artificiële bacteriële ribosomen (‘Ribo-T’)
• Extra artificiële ribosomen naast de endogene bacteriële ribosomen
• Herkent andere Shine-Dalgarno sequentie => kan andere set mRNAs transleren
Voordelen:
- endogene ribosomen kunnen endogene eiwitten maken => betere leefbaarheid
bacteriën en meer opbrengst recombinant eiwit
- mogelijkheid om artificiële aminozuren in te bouwen
Nadelen:
- staat nog niet volledig op punt
- voorlopig enkel in bacteriën
Gist
• Saccharomyces cerevisiae
6
Inhoudsopgave
1. Inleiding ....................................................................................................................................................... 2
2. Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek ................................................................................... 2
3. Analyse van RNA .......................................................................................................................................... 2
4. Eiwitten ........................................................................................................................................................ 2
4.1 Isoleren van eiwitten .................................................................................................................................... 2
4.2 Aanmaken van eiwitten ................................................................................................................................ 3
4.2.1 Chemische synthese in vitro ................................................................................................................. 3
4.2.2 Enzymatische synthese in vitro ............................................................................................................ 3
4.2.3 In vivo expressie systemen ................................................................................................................... 4
4.2.4 Bereiding van antistoffen ................................................................................................................... 10
4.3 Concentreren van eiwitten ......................................................................................................................... 14
4.3.1 UV absorptie ....................................................................................................................................... 14
4.3.2 Colorimetrische methoden ................................................................................................................. 15
4.3.3 Fluorimetrische methoden ................................................................................................................. 18
4.4 Kwantificeren en identificeren van specifieke eiwitten .............................................................................. 19
4.4.1 Uitzouten ............................................................................................................................................ 19
4.4.2 Centrifugale filters .............................................................................................................................. 20
4.4.3 Chromatografie (zie Methoden I Hfdst 1.10) ..................................................................................... 20
4.5 Kwantificeren en identificeren van specifieke eiwitten .............................................................................. 21
4.5.1 Western blotting (zie vorig jaar Hfdst 1.11) ....................................................................................... 21
4.5.2 Antilichaam micro-arrays (= membraan) ............................................................................................ 21
4.5.3 Flow cytometrie .................................................................................................................................. 22
4.5.4 ELISA ................................................................................................................................................... 24
4.5.5 RIA....................................................................................................................................................... 26
4.5.6 Immunohistochemie ........................................................................................................................... 27
5. Microscopie ................................................................................................................................................ 30
5.1 Fluorescentiemicroscopie ........................................................................................................................... 30
5.1.1 Inleiding .............................................................................................................................................. 30
5.1.2 Confocale microscopie (LSCM/SDCM) ................................................................................................ 32
5.1.3 Light sheet fluorescentie microscopie (LFSM) .................................................................................... 35
5.1.4 2-foton fluorescentie microscopie ..................................................................................................... 38
5.1.5 Total internal reflection fluorescentie microscopy (TIRFM) ............................................................... 40
5.1.6 Samengevat ........................................................................................................................................ 41
5.2 Beeldanalyse ............................................................................................................................................... 41
5.2.1 Beeldopname...................................................................................................................................... 42
5.2.2 Beeldbewerkingen .............................................................................................................................. 44
5.2.3 Samengevat ........................................................................................................................................ 46
5.3 Superresolutie microscopie ......................................................................................................................... 46
5.3.1 Inleiding .............................................................................................................................................. 46
5.3.2 Structured illumination microscopie (SIM) ......................................................................................... 47
5.3.3 Single molecule localization microscopie (SMLM-PALM/STORM) ..................................................... 50
5.3.4 Stimulated emission depletion microscopie (STED) ........................................................................... 56
5.3.5 Samengevat ........................................................................................................................................ 60
1
, 5.4 Elektronenmicroscopie (EM) ....................................................................................................................... 60
5.4.1 Inleiding .............................................................................................................................................. 61
5.4.2 Transmissie elektronen microscopie (TEM)........................................................................................ 64
5.4.3 Scanning elektronen microscopie (SEM) ............................................................................................ 71
5.4.4 Enkele voorbeelden ............................................................................................................................ 72
5.4.5 Aanvullende EM toepassingen ........................................................................................................... 72
5.4.6 Samengevat ........................................................................................................................................ 73
5.5 Scanning probe microscopie (SPM) ............................................................................................................ 74
5.5.1 Near-field scanning optical microscopy (NSOM) ................................................................................ 74
5.5.2 Tunneling microscopy (SPM) .................................................................. Error! Bookmark not defined.
5.5.3 Atomic force microscopy (AFM) ......................................................................................................... 75
5.5.4 Samengevat ........................................................................................................................................ 78
1. Inleiding
2. Biomedische vraagstelling en onderzoeksmethodiek
3. Analyse van RNA
4. Eiwitten
4.1 Isoleren van eiwitten
Homogenisatiebuffer:
- Buffer voor pH (bv Tris)
- Zout zodat eiwitten niet denatureren (bv NaCl)
- Protease inhibitoren zodat eiwitten niet afgebroken worden
o Proteasen = enzymen die eiwitten afbreken = katalyseren afbraak
peptidebindingen tussen AZ
▪ Serine protease (trypsine, thrombonine,…) → geïnhibeerd met PMSF,
Benzamidine, Aprotinine
▪ Metaloproteasen → EDTA
▪ Cysteïne proteasen → leupeptine
▪ Aspartaat proteasen → Pepstatine
o → meestal mengsel van meerdere inhibitoren (met of zonder EDTA)
- Eventueel fosfatase inhibitoren zodat fosforylaties geconserveerd blijven
o Fosfatasen = enzymen die zorgen voor defosforylatie: het weghalen van
fosfaatgroep van een ander molecule (meestal eiwit of metaboliet).
Fosfatasen zijn de tegenhangers van kinasen, die zorgen voor de toevoeging
van een fosfaatgroep aan een molecule.
▪ Serine/threonine fosfatasen → geïnhibeerd door Natrium fluoride of
pyrofosfaat, bèta-glycerofosfaat
▪ Tyrosine fosfatase → natrium orthovanadaat
o → meestal mengsel van meerdere
- Eventueel detergent voor oplossen celmembraan en voor eiwitten die niet goed
oplossen in waterige homogenisatiebuffer
- Eventueel reducerend agens om disulfidebruggen te breken
2
, ➔ Na bekomen ruw eiwitlysaat → verder opzuiveren/scheiden van eiwitten via
verschillende technieken (chromatografie, elektroforese,…)
4.2 Aanmaken van eiwitten
4.2.1 Chemische synthese in vitro
Voordelen:
- Synthese van ‘artificiële’ eiwitten = aminozuren inbouwen die niet in de natuur
voorkomen (activiteit en stabiliteit van de eiwitten neemt zo toe).
- Geen problemen met toxiciteit voor het organisme dat het eiwit moet aanmaken of
met beperkte aminozuurbeschikbaarheid in dat organisme
Nadelen:
- Koppelingsefficiëntie per cyclus 99%
=> opbrengst verlaagt bij elk extra AZ
=> enkel korte sequenties (max 50 AZ) => chemische synthese van langere eiwitten
mogelijk door koppelen van grotere peptiden
- Duur
- Relatief kleine hoeveelheden
Toepassingen:
- Aanmaak peptiden voor antistofproductie
- Aanmaak artificiële eiwitten
- ....
4.2.2 Enzymatische synthese in vitro
• in vitro translatie van RNA in konijnen
reticulocyte (= voorlopercel van een rode bloedcel. Dit zijn zeer gespecialiseerde cellen in
productie van hemoglobine die geen celkern meer hebben en die een zeer krachtige eiwit
translatie machinerie bevatten om hemoglobine te maken.) lysaat of tarwekiem (wheat
germ) extract
- bevat ribosomen
- bevat aminozuren en energie
• Vaak gekoppeld aan in vitro transcriptie (zie 2.3-27)
=> in vitro transcriptie-translatie
(zie figuur 2 reacties,
soms zelfs 1 reactie)
3
,=> Het eiwit is aangemaakt na het toevoegen van DNA (zie + DNA)
4.2.3 In vivo expressie systemen
Meestal expressie van een recombinant eiwit na introductie recombinant DNA (zie
hoofdstuk 1.13)
=> ‘Recombinante eiwitproductie’
➔ Gekozen organisme voor in vivo expressie bepaalt keuze expressie plasmide en
eiwitcoderende sequentie (codon optimisatie!). Codon optimisatie = aanpassen van
eiwit coderende DNA-sequentie naargelang organisme om hogere eiwitexpressie te
krijgen → synonieme codons gebruiken waarvan veel tRNA beschikbaar zijn in
gebruikte organisme/celtype
Er bestaat een genetische gedegenereerde code omdat meerdere codons coderen voor 1
aminozuur. Het is belangrijk dat je de DNA-sequentie gaat aanpassen aan het
modelorganisme om de efficiëntie van de translatie te verhogen.
A. Transiënte eiwitproductie over enkele dagen
(Transfectie van DNA: geen integratie van recombinant DNA in genoom expressie
organisme) => Transfectie en transductie komen in detail aan bod aan methoden 3. Dit zijn
methoden om recombinant DNA in cellen binnen te brengen. Bij transfectie integreert het
DNA niet in het genoom van de gastcel; bij transductie is er wel integratie in het genoom van
de gastcel.
4
, B. Stabiele eiwitproductie over maanden
(Transductie van DNA: integratie recombinant DNA in genoom expressie organisme)
A) Productie op laboratoriumschaal: relatief kleine volumes
B) Productie op industriële schaal: opschaling naar bioreactor productietank
Bacterieel
Voorbeelden:
• Escherichia coli (E. coli) (vaak BL21)
▪ Nadelen: Je moet E.Coli lyseren om het eiwit eruit te halen
▪ Voordelen: Weinig protease activiteit => Weinig eiwit degradatie (eiwit blijft
intact)
• Meer recent: Bacillus subtilis
-> capaciteit tot eiwitsecretie in het medium
• Nadelen bacteriële systemen:
- een juiste post-translationele modificaties (PTMs)
- eiwitten vaak slecht gevouwen en slecht oplosbaar
=> aggregatie in inclusion bodies
5
, • Voordelen:
- gemakkelijk te manipuleren en snel op te schalen
- goedkope cultuurmedia
- induceerbare promotoren: IPTG is een allolactose analoog dat de lac
repressor bindt en inactiveert => transcriptie target gen en translatie eiwit.
Achtergrondinformatie: Lac I codeert voor de Lac repressor => zolang de
repressor aanwezig is heb je geen transcriptie of translatie. Als je dan IPTG
toevoegt gaat het binden op de repressor, waardoor die loskomt en dan kan
RNA polymerase binden.
- inclusion bodies:
▪ geen last van toxiciteit voor de bacterie
▪ beschermd van proteolyse
▪ bevatten relatief zuiver en hoog geconcentreerd eiwit (refolding wel
lastig)
Artificiële bacteriële ribosomen (‘Ribo-T’)
• Extra artificiële ribosomen naast de endogene bacteriële ribosomen
• Herkent andere Shine-Dalgarno sequentie => kan andere set mRNAs transleren
Voordelen:
- endogene ribosomen kunnen endogene eiwitten maken => betere leefbaarheid
bacteriën en meer opbrengst recombinant eiwit
- mogelijkheid om artificiële aminozuren in te bouwen
Nadelen:
- staat nog niet volledig op punt
- voorlopig enkel in bacteriën
Gist
• Saccharomyces cerevisiae
6
