Samenvatting onderzoeksmethoden
Thema 3 - Farmaca, Metabolieten, Proteomics en FACS
Biomedische Wetenschappen
2020-2021
Door Nicole (studente BMW)
,Inhoudsopgave
Flow Cytometry (FACS) ............................................................................................................................ 3
Forward scatter ................................................................................................................................... 3
Side scatter .......................................................................................................................................... 3
Fluorescentie ....................................................................................................................................... 4
Onderdelen flowcytometer ................................................................................................................. 5
Vloeistofsysteem (fluidics) .............................................................................................................. 5
Optische systeem (optical system) .................................................................................................. 6
Elektronisch systeem ....................................................................................................................... 7
Kleuring.............................................................................................................................................. 10
Compensatie.................................................................................................................................. 10
Fluorescence Minus One (FMO) .................................................................................................... 12
Isotype controles ............................................................................................................................... 12
Protocol ............................................................................................................................................. 12
Data-analyse ...................................................................................................................................... 13
Soorten plots ................................................................................................................................. 13
Gates.............................................................................................................................................. 14
Stappen data-analyse .................................................................................................................... 15
Bio-analyse ............................................................................................................................................ 16
Technieken ........................................................................................................................................ 16
Uitdagingen ....................................................................................................................................... 17
Monstervoorbewerking................................................................................................................. 17
Clean-up strategieën ..................................................................................................................... 18
Interne standaard .............................................................................................................................. 21
Bepaling concentratie geneesmiddel in bloed .................................................................................. 22
Protocol ......................................................................................................................................... 23
Analyse .................................................................................................................................................. 24
UV-Vis spectrofotometrie.................................................................................................................. 24
Wet van Lambert-Beer .................................................................................................................. 24
High-performance liquid chromatography (HPLC) ............................................................................ 25
HPLC chromatogram...................................................................................................................... 25
Practicum........................................................................................................................................... 26
Protocol ......................................................................................................................................... 26
Proteomics & Massaspectrometrie ........................................................... Error! Bookmark not defined.
High-performance liquid chromatography (HPLC) ............................................................................ 28
Strong cation exchange (SCX) ........................................................................................................ 31
1
, Reversed phase liquid chromatography (RPLC) ............................................................................ 32
Massaspectrometrie (MS) ................................................................................................................. 33
Electrospray ionisatie (ESI) ............................................................................................................ 34
Massa analyse ............................................................................................................................... 34
Detectie van ionen ........................................................................................................................ 35
Q-TOF massaspectrometer................................................................................................................ 35
Quadrupole.................................................................................................................................... 36
Time-of-flight (TOF) ....................................................................................................................... 36
Werking ......................................................................................................................................... 37
Spectrum ....................................................................................................................................... 38
MS/MS analyse .................................................................................................................................. 38
Naamgeving van B-ionen en Y-ionen ............................................................................................ 39
2
,Flow Cytometry (FACS)
Flow cytometry of fluorescence activated cell sorting (FACS) is een techniek waarbij het aantal
bewegende cellen gemeten wordt. Hierbij worden tegelijkertijd meerdere kenmerken van de
afzonderlijke deeltjes (meestal cellen) gemeten en geanalyseerd terwijl ze in een vloeistofstroom
door een lichtstraal stromen. Hierdoor kunnen cellen gekarakteriseerd en geanalyseerd worden. De
metingen worden per cel uitgevoerd met snelheden van 500 tot 4000 cellen per seconde.
Het kan informatie geven over de:
• Grootte → Forward scatter (FSC)
• Interne complexiteit → Side scatter (SSC)
• Fluorescentie intensiteit (sorting) → FL1, FL2, FL3, FL4, etc.
Om een meting te doen met een flowcytometer moeten de cellen zich in een vloeibare suspensie
bevinden. Hierbij zijn deeltjes met een grootte van 0,2 - 50 µm geschikt voor flowcytometrische
analyse. Daarnaast moeten cellen uit vast weefsel eerst gedesaggregeerd worden, voordat ze
geanalyseerd kunnen worden. Met een flowcytometer kunnen allerlei deeltjes geanalyseerd worden:
• Multicellulaire organismen
• Cel aggregaten
• Eukaryotische cellen
• Cellulaire organellen
• Bacteriën
• Liposomen
• Virussen
• Enkele moleculen
Forward scatter
De forward scatter (voorwaartse verstrooiing) ontstaat door lichtdiffractie en is een maat voor de
grootte van het deeltje die door de laserbundel heengaat. Het is gerelateerd aan het celoppervlak en
wordt gemeten langs de weg van de laserbundel. Op het moment dat de laserstraal de stroom van
deeltjes raakt, zullen de meeste fotonen onbelemmerd passeren. Sommige fotonen zullen enigszins
van hun pad afwijken wanneer ze in contact komen met de membranen van passerende cellen.
Hierdoor zal het licht enigszins afbuigen (diffractie). Hierbij geldt hoe groter het obstakel, des te
meer afbuiging er plaats zal vinden. Daarnaast heeft de brekingsindex (refractive index) invloed op
de FSC. Het is een fysieke eigenschap die aangeeft hoe licht doorgelaten wordt en ervoor zorgt dat
licht buigt en van snelheid verander op het moment dat het door verschillende materialen gaat. Ook
hierbij geldt hoe groter het verschil in brekingsindex tussen de cel en de omhullingsvloeistof hoe
meer afbuiging er plaats zal vinden.
Side scatter
De side scatter (zijwaartse verstrooiing) wordt bepaald door hoe granulair en complex een cel is.
Het grensvlak tussen de laser en de intracellulaire structuren zorgen ervoor dat het licht breekt
(refract) of reflecteert. Dit wordt vervolgens gedetecteerd onder een hoek van 90° t.o.v. de
laserstraal. Aangezien de meeste cellen doorzichtig zijn, gaan veel fotonen door het cytoplasma
heen. Op het moment dat een foton een organel raakt (zoals het ER of de kern) dan zal het foton
onder een grotere hoek gereflecteerd worden dan bij voorwaartse verstrooiing. Deze verstrooiing
wordt gedetecteerd door een tweede detector die zich loodrecht op de laserbundel bevindt. Hierbij
is de zijwaartse verstrooiing recht evenredig met de complexiteit van de cel. Naarmate er meer
organellen in het cytoplasma zitten, zal er dus meer lichtverstrooiing optreden.
3
,Figuur 1 Schematische weergave van forward scattering, side scattering en hydrodynamic focusing.
Fluorescentie
Naast het meten van lichtverstrooiing wordt er ook gebruik gemaakt van fluorescente labeling.
Hierbij kan gebruik gemaakt worden van antigen-specifieke binding sites op celmembranen, waaraan
fluorescent gelabelde antilichamen kunnen binden. Daarnaast kan er gebruik gemaakt worden van
fluoroforen. Dit zijn chemische stoffen die na blootstelling van licht opnieuw licht uitzenden met een
langere golflengte. Het verschil tussen de excitatiegolflengte en emissiegolflengte wordt ook wel
stokes shift genoemd.
Er zijn verschillende soorten fluoroforen die gekarakteriseerd kunnen worden op basis van unieke
excitatie- en emissiespectra. Om de deeltjes bij FACS te identificeren zijn fluoroforen vaak gebonden
aan monoklonale antilichamen. Hierbij geldt dat naarmate een cel meer fluoroforen of gelabelde
antilichamen bindt, het dus ook een grotere fluorescentie intensiteit zal vertonen. De meeste cellen
vertonen echter ook autofluorescentie. Dit is de natuurlijke emissie van licht door biologische
structuren zoals mitochondriën en lysosomen wanneer ze licht geabsorbeerd hebben.
Figuur 2 Schematische weergave van het absorptie- en emissiespectrum van fluoroforen.
4
, Onderdelen flowcytometer
Een flowcytometer bestaat uit drie subsystemen:
• Vloeistofsysteem (fluidics):
➢ Zorgt ervoor dat de cellen blootgesteld worden aan de lichtbundel.
• Optiek (optical system):
➢ Genereert de lichtsignalen en leidt deze naar de detectoren.
• Elektronica:
➢ Zet de optische signalen om in proportionele elektrische signalen en digitaliseert ze voor
computeranalyse.
Vloeistofsysteem (fluidics)
Het vloeistofsysteem heeft twee belangrijke functies, namelijk:
• Het transporteren van deeltjes in een vloeistofstroom naar de laserstraal voor interrogation.
• Het positioneren van de sample core in het midden van de laserstraal.
Het deel van de vloeistofstroom waar de deeltjes zich bevinden wordt de sample core ofwel kern van
het monster genoemd. De plek waar de deeltjes de laserstraal ontmoeten, is de interrogation point.
Hier treedt verstrooiing van het licht op en wordt fluorescentie emissie uitgezonden. Met
hydrodynamic focusing kan de sample core in het midden van de sheath fluid (omhullingsvloeistof)
gehouden worden. Deze hydrodynamic focusing wordt mogelijk gemaakt door de vorm van de flow
cell. Daarnaast kan de druk van de sample aangepast worden om de diameter van de sample core te
vergroten of te verkleinen. Hiervoor geldt dat de druk van de sample hoger moet zijn dan de druk
van de omhullingsvloeistof.
Om de flow cytometry sneller te laten verlopen, kan de sample core breder gemaakt worden.
Hierdoor is de doorstroom van deeltjes per seconde groter. Een nadeel hiervan is dat er mogelijk ook
deeltjes langs de laserstraal afgaan, wat resulteert in een verminderde resolutie.
Figuur 3 Schematische weergave van het vloeistofsysteem (fluidics).
5
Thema 3 - Farmaca, Metabolieten, Proteomics en FACS
Biomedische Wetenschappen
2020-2021
Door Nicole (studente BMW)
,Inhoudsopgave
Flow Cytometry (FACS) ............................................................................................................................ 3
Forward scatter ................................................................................................................................... 3
Side scatter .......................................................................................................................................... 3
Fluorescentie ....................................................................................................................................... 4
Onderdelen flowcytometer ................................................................................................................. 5
Vloeistofsysteem (fluidics) .............................................................................................................. 5
Optische systeem (optical system) .................................................................................................. 6
Elektronisch systeem ....................................................................................................................... 7
Kleuring.............................................................................................................................................. 10
Compensatie.................................................................................................................................. 10
Fluorescence Minus One (FMO) .................................................................................................... 12
Isotype controles ............................................................................................................................... 12
Protocol ............................................................................................................................................. 12
Data-analyse ...................................................................................................................................... 13
Soorten plots ................................................................................................................................. 13
Gates.............................................................................................................................................. 14
Stappen data-analyse .................................................................................................................... 15
Bio-analyse ............................................................................................................................................ 16
Technieken ........................................................................................................................................ 16
Uitdagingen ....................................................................................................................................... 17
Monstervoorbewerking................................................................................................................. 17
Clean-up strategieën ..................................................................................................................... 18
Interne standaard .............................................................................................................................. 21
Bepaling concentratie geneesmiddel in bloed .................................................................................. 22
Protocol ......................................................................................................................................... 23
Analyse .................................................................................................................................................. 24
UV-Vis spectrofotometrie.................................................................................................................. 24
Wet van Lambert-Beer .................................................................................................................. 24
High-performance liquid chromatography (HPLC) ............................................................................ 25
HPLC chromatogram...................................................................................................................... 25
Practicum........................................................................................................................................... 26
Protocol ......................................................................................................................................... 26
Proteomics & Massaspectrometrie ........................................................... Error! Bookmark not defined.
High-performance liquid chromatography (HPLC) ............................................................................ 28
Strong cation exchange (SCX) ........................................................................................................ 31
1
, Reversed phase liquid chromatography (RPLC) ............................................................................ 32
Massaspectrometrie (MS) ................................................................................................................. 33
Electrospray ionisatie (ESI) ............................................................................................................ 34
Massa analyse ............................................................................................................................... 34
Detectie van ionen ........................................................................................................................ 35
Q-TOF massaspectrometer................................................................................................................ 35
Quadrupole.................................................................................................................................... 36
Time-of-flight (TOF) ....................................................................................................................... 36
Werking ......................................................................................................................................... 37
Spectrum ....................................................................................................................................... 38
MS/MS analyse .................................................................................................................................. 38
Naamgeving van B-ionen en Y-ionen ............................................................................................ 39
2
,Flow Cytometry (FACS)
Flow cytometry of fluorescence activated cell sorting (FACS) is een techniek waarbij het aantal
bewegende cellen gemeten wordt. Hierbij worden tegelijkertijd meerdere kenmerken van de
afzonderlijke deeltjes (meestal cellen) gemeten en geanalyseerd terwijl ze in een vloeistofstroom
door een lichtstraal stromen. Hierdoor kunnen cellen gekarakteriseerd en geanalyseerd worden. De
metingen worden per cel uitgevoerd met snelheden van 500 tot 4000 cellen per seconde.
Het kan informatie geven over de:
• Grootte → Forward scatter (FSC)
• Interne complexiteit → Side scatter (SSC)
• Fluorescentie intensiteit (sorting) → FL1, FL2, FL3, FL4, etc.
Om een meting te doen met een flowcytometer moeten de cellen zich in een vloeibare suspensie
bevinden. Hierbij zijn deeltjes met een grootte van 0,2 - 50 µm geschikt voor flowcytometrische
analyse. Daarnaast moeten cellen uit vast weefsel eerst gedesaggregeerd worden, voordat ze
geanalyseerd kunnen worden. Met een flowcytometer kunnen allerlei deeltjes geanalyseerd worden:
• Multicellulaire organismen
• Cel aggregaten
• Eukaryotische cellen
• Cellulaire organellen
• Bacteriën
• Liposomen
• Virussen
• Enkele moleculen
Forward scatter
De forward scatter (voorwaartse verstrooiing) ontstaat door lichtdiffractie en is een maat voor de
grootte van het deeltje die door de laserbundel heengaat. Het is gerelateerd aan het celoppervlak en
wordt gemeten langs de weg van de laserbundel. Op het moment dat de laserstraal de stroom van
deeltjes raakt, zullen de meeste fotonen onbelemmerd passeren. Sommige fotonen zullen enigszins
van hun pad afwijken wanneer ze in contact komen met de membranen van passerende cellen.
Hierdoor zal het licht enigszins afbuigen (diffractie). Hierbij geldt hoe groter het obstakel, des te
meer afbuiging er plaats zal vinden. Daarnaast heeft de brekingsindex (refractive index) invloed op
de FSC. Het is een fysieke eigenschap die aangeeft hoe licht doorgelaten wordt en ervoor zorgt dat
licht buigt en van snelheid verander op het moment dat het door verschillende materialen gaat. Ook
hierbij geldt hoe groter het verschil in brekingsindex tussen de cel en de omhullingsvloeistof hoe
meer afbuiging er plaats zal vinden.
Side scatter
De side scatter (zijwaartse verstrooiing) wordt bepaald door hoe granulair en complex een cel is.
Het grensvlak tussen de laser en de intracellulaire structuren zorgen ervoor dat het licht breekt
(refract) of reflecteert. Dit wordt vervolgens gedetecteerd onder een hoek van 90° t.o.v. de
laserstraal. Aangezien de meeste cellen doorzichtig zijn, gaan veel fotonen door het cytoplasma
heen. Op het moment dat een foton een organel raakt (zoals het ER of de kern) dan zal het foton
onder een grotere hoek gereflecteerd worden dan bij voorwaartse verstrooiing. Deze verstrooiing
wordt gedetecteerd door een tweede detector die zich loodrecht op de laserbundel bevindt. Hierbij
is de zijwaartse verstrooiing recht evenredig met de complexiteit van de cel. Naarmate er meer
organellen in het cytoplasma zitten, zal er dus meer lichtverstrooiing optreden.
3
,Figuur 1 Schematische weergave van forward scattering, side scattering en hydrodynamic focusing.
Fluorescentie
Naast het meten van lichtverstrooiing wordt er ook gebruik gemaakt van fluorescente labeling.
Hierbij kan gebruik gemaakt worden van antigen-specifieke binding sites op celmembranen, waaraan
fluorescent gelabelde antilichamen kunnen binden. Daarnaast kan er gebruik gemaakt worden van
fluoroforen. Dit zijn chemische stoffen die na blootstelling van licht opnieuw licht uitzenden met een
langere golflengte. Het verschil tussen de excitatiegolflengte en emissiegolflengte wordt ook wel
stokes shift genoemd.
Er zijn verschillende soorten fluoroforen die gekarakteriseerd kunnen worden op basis van unieke
excitatie- en emissiespectra. Om de deeltjes bij FACS te identificeren zijn fluoroforen vaak gebonden
aan monoklonale antilichamen. Hierbij geldt dat naarmate een cel meer fluoroforen of gelabelde
antilichamen bindt, het dus ook een grotere fluorescentie intensiteit zal vertonen. De meeste cellen
vertonen echter ook autofluorescentie. Dit is de natuurlijke emissie van licht door biologische
structuren zoals mitochondriën en lysosomen wanneer ze licht geabsorbeerd hebben.
Figuur 2 Schematische weergave van het absorptie- en emissiespectrum van fluoroforen.
4
, Onderdelen flowcytometer
Een flowcytometer bestaat uit drie subsystemen:
• Vloeistofsysteem (fluidics):
➢ Zorgt ervoor dat de cellen blootgesteld worden aan de lichtbundel.
• Optiek (optical system):
➢ Genereert de lichtsignalen en leidt deze naar de detectoren.
• Elektronica:
➢ Zet de optische signalen om in proportionele elektrische signalen en digitaliseert ze voor
computeranalyse.
Vloeistofsysteem (fluidics)
Het vloeistofsysteem heeft twee belangrijke functies, namelijk:
• Het transporteren van deeltjes in een vloeistofstroom naar de laserstraal voor interrogation.
• Het positioneren van de sample core in het midden van de laserstraal.
Het deel van de vloeistofstroom waar de deeltjes zich bevinden wordt de sample core ofwel kern van
het monster genoemd. De plek waar de deeltjes de laserstraal ontmoeten, is de interrogation point.
Hier treedt verstrooiing van het licht op en wordt fluorescentie emissie uitgezonden. Met
hydrodynamic focusing kan de sample core in het midden van de sheath fluid (omhullingsvloeistof)
gehouden worden. Deze hydrodynamic focusing wordt mogelijk gemaakt door de vorm van de flow
cell. Daarnaast kan de druk van de sample aangepast worden om de diameter van de sample core te
vergroten of te verkleinen. Hiervoor geldt dat de druk van de sample hoger moet zijn dan de druk
van de omhullingsvloeistof.
Om de flow cytometry sneller te laten verlopen, kan de sample core breder gemaakt worden.
Hierdoor is de doorstroom van deeltjes per seconde groter. Een nadeel hiervan is dat er mogelijk ook
deeltjes langs de laserstraal afgaan, wat resulteert in een verminderde resolutie.
Figuur 3 Schematische weergave van het vloeistofsysteem (fluidics).
5
