La clonación molecular es un proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN genómico o de ADNc
basada en la tecnología de ADN recombinante.
Pese a ser una técnica manual y que requiere varios días, ofrece importantes ventajas:
Permite obtener cantidades “ilimitadas” de la secuencia de interés.
Existe la capacidad de clonar fragmentos de diferentes tamaños, pudiéndose clonar secuencias de
ADN de gran tamaño, mucho mayores incluso que las que se pueden amplificar mediante PCR, aunque
esto dependerá del vector usado.
En un único proceso se puede clonar el genoma entero de un organismo, fragmentándolo previamente,
permitiendo la creación de genotecas de ADN o de ADNc.
Posibilita la expresión de genes o de secuencia de interés, de lo que se derivan:
Aplicaciones industriales: producción de hormonas, proteínas…
Aplicaciones en investigación, agricultura, medicina: OMGs, terapia génica…
Componentes de la clonación
2.1. Vectores de clonacion
Los vectores de clonación son moléculas de ADN que pueden replicarse autónomamente en una cél.
huésped y que permiten la inserción de ADN extraño (inserto), sin perder esa capacidad de replicaciones
autónoma.
Características de los vectores de clonación:
Tener origen de replicación (ori) que le permita replicarse en la cél. huésped.
Tener como mínimo un sitio de inserción de ADN extraño (inserto), normalmente son secuencias
diana de enzimas de restricción, presentes una única vez en la molécula. Los vectores de última
generación suelen tener múltiples dianas de restricción diferentes y únicas para posibilitar la inserción de
prácticamente cualquier ADN extraño, incluso en algunos vectores, todas las dianas de restricción se
concentran en un segmento orto del vector denominado sitio múltiple de restricción o sitio múltiple de
clonación o polylinker.
Contener algún marcador de selección, que permita distinguir las cél. que portan el vector de las que
no, normalmente son genes de resistencia a antibióticos (KmR, AmpR, RifR…)
Contener un marcador de identificación que permita distinguir las cél. que portan un vector
recombinante, con ADN extraño, de aquellas que portan un vector sin ADN extraño (lacZ).
Tipos de vectores: se diferencian por el origen de la molécula, la disposición de los elementos que lo integran
y/o el tamaño del inserto:
1
, -Plásmidos: son moléculas circulares de ADNds de origen bacteriano con capacidad autónoma de replicación.
Para cada caso particular de clonacion, a la hora de elegir el plásmido idóneo hay que tener en cuenta:
Tamaño del inserto que se puede introducir (3,5-10kb)
El nº de copias del plásmido por célula que pueda alcanzar tras su replicación en la cél. hospedadora.
Como ejemplos: pBR322, el cual transporta fragmentos pequeños (3,5-5kb) con un nº de copias bajo (aprox.
20).
-Bacteriófagos o fagos: son virus que infectan bacterias.
(No estaba en diapositivas) Una vez que el fago introduce
su material genético en el interior de la bacteria, se adueña
del control de la maquinaria metabólica de la cél. infectada
y desarrolla un ciclo lítico, consistente en la replicación
del cromosoma vírico, la síntesis de proteínas víricas, el
empaquetamiento de nuevos virus y la liberación de los
mimos al medio previa lisis celular. Algunos tipos de fagos
pueden, alternativamente, insertar temporalmente su
material genético en el cromosoma bacteriano mediante
recombinación, en lo que se denomina ciclo lisogénico.
Este es el caso de uno de los fagos más usado que es el
fago λ, en el cual se pueden incluir insertos de hasta 20kb.
(Diapositivas) La estructura del fago λ es:
Puntos de corte: EcoRI
Tamaño inserto: hasta 20kb
Extremos COS: recircularización molécula
-Cósmidos: vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del fago λ y parte de un plásmido
bacteriano. Concretamente contienen las secuencias cos del fago λ, lo que le permite empaquetar estos vectores
dentro de cápsides de fago λ, también contienen el origen de replicación (ori) de un plásmido, un gen d
resistencia y un polylinker.
Admiten insertos de mayor tamaño de hasta 50 kb.
-Fagémidos: vectores híbridos compuestos por un plásmido (con ori) al que se le inserta el ori de un fago
M13.
Cuando se introducen en una cél. hospedadora se comportan como cualquier otro vector plasmídico, pero con
la posibilidad de producir ADN monocatenario.
Estos vectores se usan en experimentos de secuenciación y en
producción de sondas monocatenarias.
-Cromosomas artificiales: son vectores para la clonación
fragmentos de gran tamaño con gran estabilidad. Se encuadran dentro
de los que se denominan vectores de alta capacidad y son idóneos para
la construcción de genotecas genómicas.
Los más usados son:
Cromosomas artificiales bacterianos (BAC): fragmentos de hasta
300kb.
Cromosomas artificiales de levaduras (YAC): fragmentos > 1Mb
2.2. Celulas hospedadoras
Las cél. hospedadoras son aquellas en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación
mediante replicación. Estas se cultivan para obtener cél. hijas clones (con igual carga genética). Su elección
depende del vector de clonación usado y de la finalidad: cél. eucariotas (levaduras, cél. vegetales, cél. animales
(insectos o mamíferos) o cél. eucariotas (bacterias, como la E. coli cepa K12, bacillus subtilis o Streptomyces).
Cél. hospedadoras bacterianas: cél. ampliamente usando como hospedadoras para clonar plásmidos, fagos
y cósmidos debido a su fácil manipulación, su gran versatilidad y la rapidez de crecimiento.
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basada en la tecnología de ADN recombinante.
Pese a ser una técnica manual y que requiere varios días, ofrece importantes ventajas:
Permite obtener cantidades “ilimitadas” de la secuencia de interés.
Existe la capacidad de clonar fragmentos de diferentes tamaños, pudiéndose clonar secuencias de
ADN de gran tamaño, mucho mayores incluso que las que se pueden amplificar mediante PCR, aunque
esto dependerá del vector usado.
En un único proceso se puede clonar el genoma entero de un organismo, fragmentándolo previamente,
permitiendo la creación de genotecas de ADN o de ADNc.
Posibilita la expresión de genes o de secuencia de interés, de lo que se derivan:
Aplicaciones industriales: producción de hormonas, proteínas…
Aplicaciones en investigación, agricultura, medicina: OMGs, terapia génica…
Componentes de la clonación
2.1. Vectores de clonacion
Los vectores de clonación son moléculas de ADN que pueden replicarse autónomamente en una cél.
huésped y que permiten la inserción de ADN extraño (inserto), sin perder esa capacidad de replicaciones
autónoma.
Características de los vectores de clonación:
Tener origen de replicación (ori) que le permita replicarse en la cél. huésped.
Tener como mínimo un sitio de inserción de ADN extraño (inserto), normalmente son secuencias
diana de enzimas de restricción, presentes una única vez en la molécula. Los vectores de última
generación suelen tener múltiples dianas de restricción diferentes y únicas para posibilitar la inserción de
prácticamente cualquier ADN extraño, incluso en algunos vectores, todas las dianas de restricción se
concentran en un segmento orto del vector denominado sitio múltiple de restricción o sitio múltiple de
clonación o polylinker.
Contener algún marcador de selección, que permita distinguir las cél. que portan el vector de las que
no, normalmente son genes de resistencia a antibióticos (KmR, AmpR, RifR…)
Contener un marcador de identificación que permita distinguir las cél. que portan un vector
recombinante, con ADN extraño, de aquellas que portan un vector sin ADN extraño (lacZ).
Tipos de vectores: se diferencian por el origen de la molécula, la disposición de los elementos que lo integran
y/o el tamaño del inserto:
1
, -Plásmidos: son moléculas circulares de ADNds de origen bacteriano con capacidad autónoma de replicación.
Para cada caso particular de clonacion, a la hora de elegir el plásmido idóneo hay que tener en cuenta:
Tamaño del inserto que se puede introducir (3,5-10kb)
El nº de copias del plásmido por célula que pueda alcanzar tras su replicación en la cél. hospedadora.
Como ejemplos: pBR322, el cual transporta fragmentos pequeños (3,5-5kb) con un nº de copias bajo (aprox.
20).
-Bacteriófagos o fagos: son virus que infectan bacterias.
(No estaba en diapositivas) Una vez que el fago introduce
su material genético en el interior de la bacteria, se adueña
del control de la maquinaria metabólica de la cél. infectada
y desarrolla un ciclo lítico, consistente en la replicación
del cromosoma vírico, la síntesis de proteínas víricas, el
empaquetamiento de nuevos virus y la liberación de los
mimos al medio previa lisis celular. Algunos tipos de fagos
pueden, alternativamente, insertar temporalmente su
material genético en el cromosoma bacteriano mediante
recombinación, en lo que se denomina ciclo lisogénico.
Este es el caso de uno de los fagos más usado que es el
fago λ, en el cual se pueden incluir insertos de hasta 20kb.
(Diapositivas) La estructura del fago λ es:
Puntos de corte: EcoRI
Tamaño inserto: hasta 20kb
Extremos COS: recircularización molécula
-Cósmidos: vectores híbridos construidos con parte del cromosoma del fago λ y parte de un plásmido
bacteriano. Concretamente contienen las secuencias cos del fago λ, lo que le permite empaquetar estos vectores
dentro de cápsides de fago λ, también contienen el origen de replicación (ori) de un plásmido, un gen d
resistencia y un polylinker.
Admiten insertos de mayor tamaño de hasta 50 kb.
-Fagémidos: vectores híbridos compuestos por un plásmido (con ori) al que se le inserta el ori de un fago
M13.
Cuando se introducen en una cél. hospedadora se comportan como cualquier otro vector plasmídico, pero con
la posibilidad de producir ADN monocatenario.
Estos vectores se usan en experimentos de secuenciación y en
producción de sondas monocatenarias.
-Cromosomas artificiales: son vectores para la clonación
fragmentos de gran tamaño con gran estabilidad. Se encuadran dentro
de los que se denominan vectores de alta capacidad y son idóneos para
la construcción de genotecas genómicas.
Los más usados son:
Cromosomas artificiales bacterianos (BAC): fragmentos de hasta
300kb.
Cromosomas artificiales de levaduras (YAC): fragmentos > 1Mb
2.2. Celulas hospedadoras
Las cél. hospedadoras son aquellas en las que se introduce el vector de clonación para su amplificación
mediante replicación. Estas se cultivan para obtener cél. hijas clones (con igual carga genética). Su elección
depende del vector de clonación usado y de la finalidad: cél. eucariotas (levaduras, cél. vegetales, cél. animales
(insectos o mamíferos) o cél. eucariotas (bacterias, como la E. coli cepa K12, bacillus subtilis o Streptomyces).
Cél. hospedadoras bacterianas: cél. ampliamente usando como hospedadoras para clonar plásmidos, fagos
y cósmidos debido a su fácil manipulación, su gran versatilidad y la rapidez de crecimiento.
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