Samenvatting Kloneren & eiwitexpressie
Er zijn verschillende soorten vectoren:
- Een plasmide = een stukje extra chromosomaal DNA van een
bacterië, dubbelstrengs die zich onafhankelijk van het DNA van de
bacterie kunnen verdubbelen. De plasmides kunnen doorgegeven
worden van de ene bacterie naar een andere bacterie doormiddel
van de Pilus. Zo worden er eigenschappen van de ene bacterie
naar de andere bacterie over gegeven. Een plasmide brengt dus
extra eigenschappen met zich mee dan alleen het genoom DNA.
- Een cosmide = Houd het DNA in de kop van de bacteriofaag, dit is dan linear, dit
bevat aan beide kante cos-sites. Als het genoom in een bacterie komt dan sluiten de
cos-sites zich en wordt het DNA circulair. Dit gebeurd omdat linear DNA door de
bacterie wordt afgebroken. In de cosmide kunnen grote stukken DNA in worden
gezet. Het onhandige is dat er maar 1
restrictieplaats bevat.
- Yac = yeast artificial chromosome vector, bevat URA3, als een gistcel dit plasmide
heeft kan het uracil afbreken, dit kun je gebruiken om te selecteren of een gistcel zon
yac in zich heeft. Je brengt deze plasmide in een gistcel, je kunt hierin een groot stuk
DNA kloneren. Yac’s worden niet veel meer gebruikt omdat het instabiel is. • CEN4:
gist centromeer • ARS1: autosomale replicatie • TEL: gist telomeren nodig voor
chromosoom replicatie • URA3; TRP1: genen voor selectie (transformanten groeien
op medium zonder deze stoffen) •
Bacteriële ori: voor replicatie in bacteriën •
AMPR : selectie in bacteriën
, - Bac = Bacterial artificial chromosomes, de
aantallen bac’s in een cel zijn heel klein,
daarom werkt het niet heel fijn. Ons genoom is
in bacs gekloneerd, en gesequenced hier is ons
genoom uit gekomen. Er kan een groot stuk
DNA in de Bac worden gezet. Het bevat lacZ
voor blauw-wit screening en
Kloning vectoren zijn plasmide die voornamelijk worden gebruikt om DNA te vermeerderen.
Een expressievector in een gespecialiseerd type kloningsvector. Deze zijn ontworpen op
transcriptie van het gekloonde gen en vertaling in eiwit mogelijk te maken.
Hiernaast is het plasmide pGLO te zien
met daarin de Ori, de promotor en de 4
selectable markers.
Orgin of replication (ori) dit zijn plekjes in het chromosomaal DNA waar dubbelstrengs DNA
geopend wordt zodat DNA replicatie kan binden en het DNA kan verdubbelen. Hier begint de
replicatie. Er zijn hele actieve orgin of replicatie deze vermenigvuldigen zich vaak, zodat er
meer plasmides met bepaalde genen in de cel zijn en er meer eiwitten gevormd zullen
worden. Een voorbeeld van een eiwit is GFP is het pGLO plasmide.
Een promotor is een plek waar transcriptie factoren binden zodat er transcriptie wordt
gestart. De promotor kan dus een gen aanzetten
om uiteindelijk eiwit van de maken. Elk gen heeft
zijn eigen promotor. In een plasmide zitten dus
meerdere promotors.
,Multiple cloning site: Is 1 unieke plek op de plasmide waar veel restrictie
knipsites zitten om de plasmide te knippen. En zo kun je er een gen in
kloneren.
De selectable markers
- Ampicilline resistance gen codeerd voor Beta-
lactamase, beta-lactamase breekt ampicilline
af, waardoor de cel kan blijven leven. Als een
plasmide dus dit gen bevat wordt er beta-
lactamase gemaakt die ampicilline afbreekt.
Hierdoor kunnen cellen die dit gen bevatten
op een plaat met ampicilline leven en cellen
die dit gen niet bevatten kunnen niet op die
plaat leven.
- Tetracyline gen, dit werkt hetzelfde als het ampicilline gen maar zorgt dan voor
resistentie van tetracyline resistentie.
- GFP zorgt ervoor dat de cel fluoriseert.
Zie hier nog
andere selectable
markers met hun
werking
M13 is een natuurlijk voorkomende bacteriofaag die een enkelstrengs circulair genoom van
ongeveer 6400 basen bevat dat alleen darmbacteriën infecteert die de F-factor bevatten of
het F-pilus-eiwit produceren. Het infecterende virus wordt omgezet in een dubbelstrengs
circulaire replicatieve vorm die kan worden gezuiverd en verteerd met restrictie-enzymen die
vergelijkbaar zijn met bacteriële plasmiden.
Een bacteriofaag bestaat uit een kop , een staart en staart vezels. De kop bevat de faag
dubbelstrengs lineair DNA -genoom. Tijdens infectie, het faagdeeltje herkent en bindt de
gastheer E. coli , waardoor DNA in de kop van de faag door de staart wordt uitgestoten in het
cytoplasma van de bacteriële cel. Gewoonlijk wordt een " lytische cyclus " optreedt, waarbij de
lambda DNA wordt gerepliceerd en nieuwe faagdeeltjes geproduceerd in de cel. Dit wordt
gevolgd door cel lysis , loslaten van de celinhoud, waaronder virions die zijn geassembleerd, in
het milieu. Onder bepaalde omstandigheden, het faag-
DNA kan integreren in het ontvangende chromosoom
in de lysogene route. In deze toestand wordt de λ DNA
genoemd profaag en blijft resident in het
gastheer genoom zonder zichtbare schade aan de
gastheer. De gastheer wordt genoemd
een lysogeen wanneer een profaag aanwezig is. Dit
profaag kan de lytische vast te zetten wanneer de
lysogeen voert een gespannen toestand.
, Kloneer stappenplan:
1. Isoleer DNA vanuit een organisme
2. Knip het insert DNA m.b.v. restrictie enzymen
3. Ligeer het insert in het voor geknipte plasmide (Oftewel ‘plakken’ van het DNA)
4. Transformatie/amplificatie
5. Kloon selectie (van plaat)
6. Validatie van kloons –analyse (Restrictie analyse, Southern blot, PCR, DNA sequencing)
Restrictie enzymen: enzymen die een unieke sequentie
herkennen en daar knippen. De enzymen kunnen sticky ends
knippen of blunt knippen. Het is handiger om te knippen met
enzymen die sticky ends knippen want die kun je zo weer ligeren
omdat het een overhang heeft. Je gebruikt het liefste 2
verschillende restrictie enzymen zodat het insert goed in de
plasmide wordt gezet en niet omgedraaid. Zo weet je zeker dat
het startcodon op de goede plek komt en er goed eiwit wordt
gemaakt.
Isoschizomeren zijn paren restrictie-enzymen die specifiek zijn voor dezelfde
herkenningssequentie. SphI (CGTAC / G) en BbuI (CGTAC / G) zijn bijvoorbeeld
isoschizomeren van elkaar.
Methylering is een gecontroleerde overdracht van een methylgroep = CH3 (één koolstof en
drie waterstofatomen) op eiwitten, aminozuren, enzymen en DNA. Dit gebeurd in elke cel
van het lichaam om genezing te reguleren, cel-energie te metaboliseren, genetische
expressie van DNA te reguleren, lever ontgifting te stimuleren, immuniteit te optimaliseren en
neurologische functies te onderhouden. Methylatie vind plaats in verschillende, met elkaar
verbonden processen, in het lichaam; de BH4-cyclus, folaatcyclus, methionine-cyclus, CBS-
metabolisme = transsulferatie, NO-cyclus, ureumcyclus en citroenzuurcyclus.
Methyl donoren zijn o.a.betaine, 5-MTHF, methionine en S-adenosylmethionine (SAMe).
Er zijn verschillende soorten vectoren:
- Een plasmide = een stukje extra chromosomaal DNA van een
bacterië, dubbelstrengs die zich onafhankelijk van het DNA van de
bacterie kunnen verdubbelen. De plasmides kunnen doorgegeven
worden van de ene bacterie naar een andere bacterie doormiddel
van de Pilus. Zo worden er eigenschappen van de ene bacterie
naar de andere bacterie over gegeven. Een plasmide brengt dus
extra eigenschappen met zich mee dan alleen het genoom DNA.
- Een cosmide = Houd het DNA in de kop van de bacteriofaag, dit is dan linear, dit
bevat aan beide kante cos-sites. Als het genoom in een bacterie komt dan sluiten de
cos-sites zich en wordt het DNA circulair. Dit gebeurd omdat linear DNA door de
bacterie wordt afgebroken. In de cosmide kunnen grote stukken DNA in worden
gezet. Het onhandige is dat er maar 1
restrictieplaats bevat.
- Yac = yeast artificial chromosome vector, bevat URA3, als een gistcel dit plasmide
heeft kan het uracil afbreken, dit kun je gebruiken om te selecteren of een gistcel zon
yac in zich heeft. Je brengt deze plasmide in een gistcel, je kunt hierin een groot stuk
DNA kloneren. Yac’s worden niet veel meer gebruikt omdat het instabiel is. • CEN4:
gist centromeer • ARS1: autosomale replicatie • TEL: gist telomeren nodig voor
chromosoom replicatie • URA3; TRP1: genen voor selectie (transformanten groeien
op medium zonder deze stoffen) •
Bacteriële ori: voor replicatie in bacteriën •
AMPR : selectie in bacteriën
, - Bac = Bacterial artificial chromosomes, de
aantallen bac’s in een cel zijn heel klein,
daarom werkt het niet heel fijn. Ons genoom is
in bacs gekloneerd, en gesequenced hier is ons
genoom uit gekomen. Er kan een groot stuk
DNA in de Bac worden gezet. Het bevat lacZ
voor blauw-wit screening en
Kloning vectoren zijn plasmide die voornamelijk worden gebruikt om DNA te vermeerderen.
Een expressievector in een gespecialiseerd type kloningsvector. Deze zijn ontworpen op
transcriptie van het gekloonde gen en vertaling in eiwit mogelijk te maken.
Hiernaast is het plasmide pGLO te zien
met daarin de Ori, de promotor en de 4
selectable markers.
Orgin of replication (ori) dit zijn plekjes in het chromosomaal DNA waar dubbelstrengs DNA
geopend wordt zodat DNA replicatie kan binden en het DNA kan verdubbelen. Hier begint de
replicatie. Er zijn hele actieve orgin of replicatie deze vermenigvuldigen zich vaak, zodat er
meer plasmides met bepaalde genen in de cel zijn en er meer eiwitten gevormd zullen
worden. Een voorbeeld van een eiwit is GFP is het pGLO plasmide.
Een promotor is een plek waar transcriptie factoren binden zodat er transcriptie wordt
gestart. De promotor kan dus een gen aanzetten
om uiteindelijk eiwit van de maken. Elk gen heeft
zijn eigen promotor. In een plasmide zitten dus
meerdere promotors.
,Multiple cloning site: Is 1 unieke plek op de plasmide waar veel restrictie
knipsites zitten om de plasmide te knippen. En zo kun je er een gen in
kloneren.
De selectable markers
- Ampicilline resistance gen codeerd voor Beta-
lactamase, beta-lactamase breekt ampicilline
af, waardoor de cel kan blijven leven. Als een
plasmide dus dit gen bevat wordt er beta-
lactamase gemaakt die ampicilline afbreekt.
Hierdoor kunnen cellen die dit gen bevatten
op een plaat met ampicilline leven en cellen
die dit gen niet bevatten kunnen niet op die
plaat leven.
- Tetracyline gen, dit werkt hetzelfde als het ampicilline gen maar zorgt dan voor
resistentie van tetracyline resistentie.
- GFP zorgt ervoor dat de cel fluoriseert.
Zie hier nog
andere selectable
markers met hun
werking
M13 is een natuurlijk voorkomende bacteriofaag die een enkelstrengs circulair genoom van
ongeveer 6400 basen bevat dat alleen darmbacteriën infecteert die de F-factor bevatten of
het F-pilus-eiwit produceren. Het infecterende virus wordt omgezet in een dubbelstrengs
circulaire replicatieve vorm die kan worden gezuiverd en verteerd met restrictie-enzymen die
vergelijkbaar zijn met bacteriële plasmiden.
Een bacteriofaag bestaat uit een kop , een staart en staart vezels. De kop bevat de faag
dubbelstrengs lineair DNA -genoom. Tijdens infectie, het faagdeeltje herkent en bindt de
gastheer E. coli , waardoor DNA in de kop van de faag door de staart wordt uitgestoten in het
cytoplasma van de bacteriële cel. Gewoonlijk wordt een " lytische cyclus " optreedt, waarbij de
lambda DNA wordt gerepliceerd en nieuwe faagdeeltjes geproduceerd in de cel. Dit wordt
gevolgd door cel lysis , loslaten van de celinhoud, waaronder virions die zijn geassembleerd, in
het milieu. Onder bepaalde omstandigheden, het faag-
DNA kan integreren in het ontvangende chromosoom
in de lysogene route. In deze toestand wordt de λ DNA
genoemd profaag en blijft resident in het
gastheer genoom zonder zichtbare schade aan de
gastheer. De gastheer wordt genoemd
een lysogeen wanneer een profaag aanwezig is. Dit
profaag kan de lytische vast te zetten wanneer de
lysogeen voert een gespannen toestand.
, Kloneer stappenplan:
1. Isoleer DNA vanuit een organisme
2. Knip het insert DNA m.b.v. restrictie enzymen
3. Ligeer het insert in het voor geknipte plasmide (Oftewel ‘plakken’ van het DNA)
4. Transformatie/amplificatie
5. Kloon selectie (van plaat)
6. Validatie van kloons –analyse (Restrictie analyse, Southern blot, PCR, DNA sequencing)
Restrictie enzymen: enzymen die een unieke sequentie
herkennen en daar knippen. De enzymen kunnen sticky ends
knippen of blunt knippen. Het is handiger om te knippen met
enzymen die sticky ends knippen want die kun je zo weer ligeren
omdat het een overhang heeft. Je gebruikt het liefste 2
verschillende restrictie enzymen zodat het insert goed in de
plasmide wordt gezet en niet omgedraaid. Zo weet je zeker dat
het startcodon op de goede plek komt en er goed eiwit wordt
gemaakt.
Isoschizomeren zijn paren restrictie-enzymen die specifiek zijn voor dezelfde
herkenningssequentie. SphI (CGTAC / G) en BbuI (CGTAC / G) zijn bijvoorbeeld
isoschizomeren van elkaar.
Methylering is een gecontroleerde overdracht van een methylgroep = CH3 (één koolstof en
drie waterstofatomen) op eiwitten, aminozuren, enzymen en DNA. Dit gebeurd in elke cel
van het lichaam om genezing te reguleren, cel-energie te metaboliseren, genetische
expressie van DNA te reguleren, lever ontgifting te stimuleren, immuniteit te optimaliseren en
neurologische functies te onderhouden. Methylatie vind plaats in verschillende, met elkaar
verbonden processen, in het lichaam; de BH4-cyclus, folaatcyclus, methionine-cyclus, CBS-
metabolisme = transsulferatie, NO-cyclus, ureumcyclus en citroenzuurcyclus.
Methyl donoren zijn o.a.betaine, 5-MTHF, methionine en S-adenosylmethionine (SAMe).
