Module LFL311VN Geavanceerd DNA onderzoek
Hoorcollege 1; Sample collection & Isolatie
Scheidien &
Sampling Extractie Kwantificaite Amplificaite Data analyse rapportage
detectie
Waar moet je op letten in het laboratorium?
Voor elk sample andere
Alles wat nat is aan de
Let op contaminatie handschoenen aan & Alles appart verpakken
lucht laten drogen
tools schoonmaken
Houd rekening met
Verpak in papier zodat Bewaar droog en koud stempelen
Genoeg bewaren voor
het kan ademen en zo (voorkoming van
verder onderzoek (Contra Sporenbeeld behouden
schimmelvorming kan degradatie en
expertise) bij net T-shirt door papier
worden voorkomen bacteriegroei)
te tussen te vouwen
Eerste stappen in het laboratorium:
Gebruik normaal licht, Beschrijf alles wat je
Spreiden op foto's maken en Ga opzoek naar sporen scheerlicht, een loep, vindt en bedenk hoe je
onderzoekstafel aantekeningen hoe het en markeer die in je ALS en andere die specifieke sporen
eruit ziet aantekeningen hulpmiddelen die je gaat verzamelen van
kunnen helpen het object
Welke 5 celtypen komen het meeste voor?
Witte Sperma cellen Buccale Haar wortels Huidcellen
bloedcellen epitheelcellen
(cellen vanuit
de mond)
Epitheelcellen komen in veel verschillende vormen voor en zijn daarom dus ook heel interessant.
Het verzamelen van hele kleine hoeveelheden DNA:
Aanraakspoor van een droog niet poreus oppervlakte (bijv. raam)
Geen katoen, want dat inhibeerd
Eerste swab nat en de tweede droog. Gebruik de PCR en houd sample vast.
hiervoor steriel en DNAse en RNAse vrij
2 swab Wel Polyester of nylon, want deze
gedestilleerd water zodat het monster niet
methode inhibeerd de PCR niet, geeft betere
gecontamineerd kan worden en het DNA niet
wordt afgebroken afgifte van het sample en
makkelijker hanteerbaar
1
, Aanraakspoor van een nat spoor (bijv.
bloed)
Vaak is 1 droge
swab voldoende,
1 droge swab De swabs mogen
2 kan ook als je
methode worden gepooled
weining DNA
vermoed
Aanraakspoor van o.a. textiel (bijv. vingerafdrukken)
Met de plakkende zijde aan de
buitenkant ga je meerdere keren Je kan op dit materiaal eerst een
over de plek heen waar je het DNA gun shot residue analyse doen
plakband gebruik (cellotape)
verwacht. het stukje plakband kan voordat je DNA gaat analyseren.
je dan direct in een epje doen voor Bij papier kan je ook knippen
de extractie.
Bij een peuk haal je voorzichtig met een steriele pincet en schaar het vloeipapier van de peuk aan de kant waar iemand het
in zijn mond zou hebben. Knip met een schaar voorzichtig stukjes. Gebruik een aantal van deze stukjes voor isolatie. Zorg
ervoor dat het filter niet wordt geraakt.
Bezorgdheid over contaminatie
- Impact van andere forensische onderzoeken
o Andere forensische onderzoeken kunnen het Sample (bijv. DNA) “besmetten” met hun eigen DNA.
- Tweede transport studies
o Primaire overdracht & secundaire overdracht van DNA-samples
Kan een DNA-profiel worden verkregen van verzamelde cellen die zijn overgedragen via een
tweede contact in plaats van het primaire contact van de originelen? Ja, maar is afhankelijk
van de textuur en vloeibaarheid van de sample.
- Nep DNA en sample verificatie
o Soms wordt er ook nep DNA op een PD neergelegd
Presumptive vs confirmatory
Presumptive een idee krijgen van wat het spoor ongeveer is (indicatie)
Confirmatory bevestiging van het type biologisch spoor een soort specificiteit (bevestigend)
PCR-remmers en DNA-degradatie
PCR-remmers in forensische casussen zijn voornamelijk hemoglobine en indigo verf voor denim. Melatonine in haar samples
kunnen de PCR remmen bij mitochondriaal DNA. Deze remmers binden aan de actieve zijde van de taq DNA-polymerase.
DNA-degradatie komt door verschillende mechanismes zoals enzymatisch en chemische processen. Zodra een organisme
sterft, worden zijn DNA-moleculen geconfronteerd met cellulaire nucleasen, gevolgd door aanvallen van bacteriën,
schimmels en insecten, afhankelijk van de omgevingsomstandigheden. Bovendien kunnen hydrolytische splitsing en
oxidatieve baseschade het succesvol ophalen en amplificeren van DNA beperken.
RISD
Het is een Lateral flow immunochromatographic assay dat is een soort
immunoassay die capillaire werking gebruikt om een sample over een vast
substraat te leiden. Gebruikt 2 muis monoclonale antilichamen specifiek voor
bepaalde menselijke antigenen.
2
,Glycophorin A voor bloed, semenogelin voor sperma, α-amylase voor speeksel. 1 van de antilichamen is gebonden aan
immunogoud. Dat zijn een soort Nano deeltjes goud in suspensie het Antilichaam-immunogoud complex wordt gebonden op
zo’n manier dat het makkelijk wegwast. Ander antilichaam is gebonden aan de ‘test’ lijn. Anti-muis IgG antilichaam is
gebonden aan de ‘controle’ lijn.
Isolatiemethode
Chelex (klassieke Fenol-Chloroform, = Solid Phase Extraction FTA papier
methode) organische extractie (SPE) de meeste kits Erg stabiel DNA
Simpel, snel, goedkoop, Niet gefragmenteerd maken daar gebruik van Statische elektriciteit
weinig disposables DNA, zuiver, goedkoop Bevatten meerdere
PCR Inhibitie Veel werk en toxische protocollen voor
vloeistoffen verschillende sample
types
Op basis van silica
adsorptie
DNA-isolatie wordt opgedeeld in 4 stappen
Denaturatie van proteïne DNA scheiding van
Verstoring van het gedenatureerde
- Soms deels precipitatie Elutie van DNA
celmembraan = cellyse proteïnen en andere
= neerslag cellulaire compontenten
Isolatie – SPE
Lyseren met behulp van proteïnsase DNA denatureren met behulp van Door het toevoegen van buffer en
K en buffer temperatuur het centrifugeren worden
Breken membraan en proteïme als DNAse Zodat het kan binden onzuiverheden weg gewassen.
Nucleïnezuur adsorbeerd aan silica
Buffers worden gekozen zodat
korrels in de aanwezigheid van hoge
verschillende onzuiverheden er
concentraties chaotrope zouten en
beter in oplossen
een neutrale of zure pH.
Een meer basische buffer zonder
zout, laat het DNA weer los en kan
het ge-elueerd worden.
Chao
trope zouten verstoren de waterstofbruggen i n een waterige oplossing. Waardoor gedenatureerd DNA meer thermostabiel
is dan wanneer het gevouwen is. Met als gevolg dat het DNA kan binden aan de silica.
3
, Moeilijke samples
Sperma en haar Botten en tanden
Di sulfide bruggen beschermen de chromatine waardoor DNA Bestaan mede uit hydroxy-apatiet
extractie lastig is
Door DTT toe te voegen aan de extractie, worden de S-S-bruggen DNA heeft een hoge affiniteit met hydroxy-apatiet
(di sulfide bruggen) afgebroken en kan er alsnog geëxtraheerd
worden.
Door het sample te verpulveren en te ontkalken is
DNA extractie alsnog mogelijk
Differentiaal isolatie protocol
Voor zedenzaken waar zowel sperma als vrouwelijk epitheelcellen aanwezig kunnen zijn. Spermacellen worden alleen
gelyseerd bij aanwezigheid van DDT, dus kan je relatief makkelijk het vrouwelijk van het mannelijk DNA scheiden. Voorkomt
mogelijk het analyseren van lastige mengprofielen. Donoren scheiden bijvoorbeeld mannen/vrouwen.
Qiagen Extractie chemie en kits
Silica extractie, nucleïnezuren absorberen selectief tot silica op een drager, zoals kleine glasparels.
Binden van
Lyseren van Vrijkomen DNA aan Wegwassen Elutie van
Schoon DNA
de cellen van DNA magnetische van "beads" het DNA
"beads"
Hoorcollege 2; qPCR
Gebaseerd op normale PCR, dus primers, Taq polymerase en buffer. De samples zijn gDNA< en mRNA.
Het wordt ook wel Real-Time PCR genoemd en het is kwantitatieve door het fluorescerende signaal wat wordt afgegeven
tijdens de amplificatie.
4
Hoorcollege 1; Sample collection & Isolatie
Scheidien &
Sampling Extractie Kwantificaite Amplificaite Data analyse rapportage
detectie
Waar moet je op letten in het laboratorium?
Voor elk sample andere
Alles wat nat is aan de
Let op contaminatie handschoenen aan & Alles appart verpakken
lucht laten drogen
tools schoonmaken
Houd rekening met
Verpak in papier zodat Bewaar droog en koud stempelen
Genoeg bewaren voor
het kan ademen en zo (voorkoming van
verder onderzoek (Contra Sporenbeeld behouden
schimmelvorming kan degradatie en
expertise) bij net T-shirt door papier
worden voorkomen bacteriegroei)
te tussen te vouwen
Eerste stappen in het laboratorium:
Gebruik normaal licht, Beschrijf alles wat je
Spreiden op foto's maken en Ga opzoek naar sporen scheerlicht, een loep, vindt en bedenk hoe je
onderzoekstafel aantekeningen hoe het en markeer die in je ALS en andere die specifieke sporen
eruit ziet aantekeningen hulpmiddelen die je gaat verzamelen van
kunnen helpen het object
Welke 5 celtypen komen het meeste voor?
Witte Sperma cellen Buccale Haar wortels Huidcellen
bloedcellen epitheelcellen
(cellen vanuit
de mond)
Epitheelcellen komen in veel verschillende vormen voor en zijn daarom dus ook heel interessant.
Het verzamelen van hele kleine hoeveelheden DNA:
Aanraakspoor van een droog niet poreus oppervlakte (bijv. raam)
Geen katoen, want dat inhibeerd
Eerste swab nat en de tweede droog. Gebruik de PCR en houd sample vast.
hiervoor steriel en DNAse en RNAse vrij
2 swab Wel Polyester of nylon, want deze
gedestilleerd water zodat het monster niet
methode inhibeerd de PCR niet, geeft betere
gecontamineerd kan worden en het DNA niet
wordt afgebroken afgifte van het sample en
makkelijker hanteerbaar
1
, Aanraakspoor van een nat spoor (bijv.
bloed)
Vaak is 1 droge
swab voldoende,
1 droge swab De swabs mogen
2 kan ook als je
methode worden gepooled
weining DNA
vermoed
Aanraakspoor van o.a. textiel (bijv. vingerafdrukken)
Met de plakkende zijde aan de
buitenkant ga je meerdere keren Je kan op dit materiaal eerst een
over de plek heen waar je het DNA gun shot residue analyse doen
plakband gebruik (cellotape)
verwacht. het stukje plakband kan voordat je DNA gaat analyseren.
je dan direct in een epje doen voor Bij papier kan je ook knippen
de extractie.
Bij een peuk haal je voorzichtig met een steriele pincet en schaar het vloeipapier van de peuk aan de kant waar iemand het
in zijn mond zou hebben. Knip met een schaar voorzichtig stukjes. Gebruik een aantal van deze stukjes voor isolatie. Zorg
ervoor dat het filter niet wordt geraakt.
Bezorgdheid over contaminatie
- Impact van andere forensische onderzoeken
o Andere forensische onderzoeken kunnen het Sample (bijv. DNA) “besmetten” met hun eigen DNA.
- Tweede transport studies
o Primaire overdracht & secundaire overdracht van DNA-samples
Kan een DNA-profiel worden verkregen van verzamelde cellen die zijn overgedragen via een
tweede contact in plaats van het primaire contact van de originelen? Ja, maar is afhankelijk
van de textuur en vloeibaarheid van de sample.
- Nep DNA en sample verificatie
o Soms wordt er ook nep DNA op een PD neergelegd
Presumptive vs confirmatory
Presumptive een idee krijgen van wat het spoor ongeveer is (indicatie)
Confirmatory bevestiging van het type biologisch spoor een soort specificiteit (bevestigend)
PCR-remmers en DNA-degradatie
PCR-remmers in forensische casussen zijn voornamelijk hemoglobine en indigo verf voor denim. Melatonine in haar samples
kunnen de PCR remmen bij mitochondriaal DNA. Deze remmers binden aan de actieve zijde van de taq DNA-polymerase.
DNA-degradatie komt door verschillende mechanismes zoals enzymatisch en chemische processen. Zodra een organisme
sterft, worden zijn DNA-moleculen geconfronteerd met cellulaire nucleasen, gevolgd door aanvallen van bacteriën,
schimmels en insecten, afhankelijk van de omgevingsomstandigheden. Bovendien kunnen hydrolytische splitsing en
oxidatieve baseschade het succesvol ophalen en amplificeren van DNA beperken.
RISD
Het is een Lateral flow immunochromatographic assay dat is een soort
immunoassay die capillaire werking gebruikt om een sample over een vast
substraat te leiden. Gebruikt 2 muis monoclonale antilichamen specifiek voor
bepaalde menselijke antigenen.
2
,Glycophorin A voor bloed, semenogelin voor sperma, α-amylase voor speeksel. 1 van de antilichamen is gebonden aan
immunogoud. Dat zijn een soort Nano deeltjes goud in suspensie het Antilichaam-immunogoud complex wordt gebonden op
zo’n manier dat het makkelijk wegwast. Ander antilichaam is gebonden aan de ‘test’ lijn. Anti-muis IgG antilichaam is
gebonden aan de ‘controle’ lijn.
Isolatiemethode
Chelex (klassieke Fenol-Chloroform, = Solid Phase Extraction FTA papier
methode) organische extractie (SPE) de meeste kits Erg stabiel DNA
Simpel, snel, goedkoop, Niet gefragmenteerd maken daar gebruik van Statische elektriciteit
weinig disposables DNA, zuiver, goedkoop Bevatten meerdere
PCR Inhibitie Veel werk en toxische protocollen voor
vloeistoffen verschillende sample
types
Op basis van silica
adsorptie
DNA-isolatie wordt opgedeeld in 4 stappen
Denaturatie van proteïne DNA scheiding van
Verstoring van het gedenatureerde
- Soms deels precipitatie Elutie van DNA
celmembraan = cellyse proteïnen en andere
= neerslag cellulaire compontenten
Isolatie – SPE
Lyseren met behulp van proteïnsase DNA denatureren met behulp van Door het toevoegen van buffer en
K en buffer temperatuur het centrifugeren worden
Breken membraan en proteïme als DNAse Zodat het kan binden onzuiverheden weg gewassen.
Nucleïnezuur adsorbeerd aan silica
Buffers worden gekozen zodat
korrels in de aanwezigheid van hoge
verschillende onzuiverheden er
concentraties chaotrope zouten en
beter in oplossen
een neutrale of zure pH.
Een meer basische buffer zonder
zout, laat het DNA weer los en kan
het ge-elueerd worden.
Chao
trope zouten verstoren de waterstofbruggen i n een waterige oplossing. Waardoor gedenatureerd DNA meer thermostabiel
is dan wanneer het gevouwen is. Met als gevolg dat het DNA kan binden aan de silica.
3
, Moeilijke samples
Sperma en haar Botten en tanden
Di sulfide bruggen beschermen de chromatine waardoor DNA Bestaan mede uit hydroxy-apatiet
extractie lastig is
Door DTT toe te voegen aan de extractie, worden de S-S-bruggen DNA heeft een hoge affiniteit met hydroxy-apatiet
(di sulfide bruggen) afgebroken en kan er alsnog geëxtraheerd
worden.
Door het sample te verpulveren en te ontkalken is
DNA extractie alsnog mogelijk
Differentiaal isolatie protocol
Voor zedenzaken waar zowel sperma als vrouwelijk epitheelcellen aanwezig kunnen zijn. Spermacellen worden alleen
gelyseerd bij aanwezigheid van DDT, dus kan je relatief makkelijk het vrouwelijk van het mannelijk DNA scheiden. Voorkomt
mogelijk het analyseren van lastige mengprofielen. Donoren scheiden bijvoorbeeld mannen/vrouwen.
Qiagen Extractie chemie en kits
Silica extractie, nucleïnezuren absorberen selectief tot silica op een drager, zoals kleine glasparels.
Binden van
Lyseren van Vrijkomen DNA aan Wegwassen Elutie van
Schoon DNA
de cellen van DNA magnetische van "beads" het DNA
"beads"
Hoorcollege 2; qPCR
Gebaseerd op normale PCR, dus primers, Taq polymerase en buffer. De samples zijn gDNA< en mRNA.
Het wordt ook wel Real-Time PCR genoemd en het is kwantitatieve door het fluorescerende signaal wat wordt afgegeven
tijdens de amplificatie.
4
