METHODEN: EIWITTEN
Eiwitten zijn een hele grote complexe klasse van moleculen met heel grote verscheidenheid. De
verscheidenheid is zowel tussen de sequenties als in de structuren en de functies. De eiwitten
hebben een dynamische regeling (modificaties bv). Ze zijn direct betrokken bij fysiologie en
pathologie. Ze zijn hierdoor dus ook een interessante target voor therapie.
Sequentiebepaling
Edman degradatie
Er wordt een molecule toegevoegd aan het eiwit. Het molecule bestaat uit 2 delen:
aromatische ring die helpt om achteraf te kunnen detecteren en een reactieve groep
aan de N-terminus die gaat reageren bij een pH verandering → shuffeling van H+. Hierdoor gaat het
laatste AZ afgesplitst worden en dit kan zo herhaald worden om de AZ sequentie te bepalen.
Sequentiebepaling volgens Edman degradatie is erg omslachtig → 40-60 AZ per peptide.
Dit systeem is ondertussen geautomatieseerd en de eiwitsequenties worden opgeslagen in
databanken bv SWISS-PROT. De sequenties zijn vaak afgeleid van DNA. Maar de sequentiebepaling
wordt nu meer en meer gedaan met MS ipv Edman degradatie.
Eiwit sequentiebepaling via massa spectrometrie (MS)
Het eiwit moet eerst opgezuiverd worden met behulp van bepaalde proteasen kunnen de eiwitten
geknipt worden. Allemaal kleine peptiden die afkomstig zijn van hetzelfde eiwit.
MALDI-TOF: deze methoden gebruikt ionisering, de lading in deze methode is heel belangrijk. De
lading gaat de moleculen doen bewegen en gaat ook zorgen dat ze gedetecteerd kunnen worden.
Men gebruikt een matrix. Een laser gaat dan de matrix doen ioniseren zodat er bepaalde moleculen
uit het staal geschoten kunnen worden → komt dan in TOF (time of life) terecht.
Een buis falcon. De kleine moleculen gaan hier sneller in bewegen dan de grotere waardoor ze zo op
basis van grote gescheiden worden. Door de lading aanwezig kan zo de grote van het stukje peptide
bepaald worden. Deze data kunnen dan vergeleken worden met databanken om te bepalen welke
eiwitten aanwezig zijn.
Tandem-MS: ook een vorm van ionisatie. Elektro spray ionization. Vloietsof met een bepaalde druk
gaat door een buis gedaan worden waardoor er een soort spray ontstaat. De moleculen die hierdoor
gaan krijgen een bepaalde lading. De moleculen komen dan in het MS/MS systeem dat gebruik
maakt van een quadripool.
Quadripool = 4 metalen staven onder stroom die bepaalde stoffen doorlaten afhankelijk van de
stroom die erdoor gaat en afhankelijk van de lading kunnen ze erdoor of niet. 1ste is voor massa
bepaling vaak ook nog een collision cell → de eiwitten van de eerste gaan dan in stukken gebruoken
worden en dan gaat men kleine stukjes meten (kan tot op AZ niveau → meer info maar meer
omslachtig).
Werkwijze:
1. Eiwit knippen met protease (bij voorkeur Trypsine – knipt na een Arg)
o Endopeptidase → geeft fragmenten van <20 AZ
o Peptiden hebben een C-terminaal basisch residu
o Na ionisatie: 2 pos ladingen: NH2 C-terminaal → anders geknipt andere lading
eenvoudiger spectrum als alle peptiden een dubbele lading hebben
1
,2. Scheiding eiwitfragmenten
o Kolomchromatografie: vb reverse phase
o 2D elektroforese voor zeer complexe mengsels
o Verwijderen contaminanten (vb buffercomponenten:
detergenten, zouten)
o Directe koppeling met MS mogelijk
o Zeer kleine volumes volstaan
i. Microschaal HPLC
ii. Capillaire elektroforese
iii. Microvloeistof chips
3. MS van gescheiden peptiden
o Chromatografie direct koppelen aan MS
o Per tijdspint kan een m/z spectrum van peptiden worden
verkregen
o Clusters peptide isotopen worden zichtbaar
- MALDI/TOF
Resultaat = “handtekening” eiwit = verzending peptide massa’s
vergelijking ‘peptide mass fingerprint’ met verwachte peptide
massa’s uit databases
- MS/MS
Verdere fragmentatie in ‘collision cell’
4. Peptide fragmentatie in een botsongscel (enkel bij MS/MS) → AZ bepaling
o Botsing met inert gas (je kan zelf kiezen hoe hard ze botsen)
o Afhankelijk van de energie worden preferentieel bepaalde bindingen gesplitst
i. x,y,z: vanaf C-terminus
ii. a,b,c: vanaf N-terminus
iii. Subscript wijst op aantal AZ in fragment → Y1 = 1 AZ; Y2 = 2 AZ
iv. Y en B zijn de zwakste bindingen en daar heb je dus de meeste fragmenten
van → dit geeft hele complexe massacomplexen
o Sequentie peptide kan worden bepaald adhv spectrum
MS/MS spectra kunnen heel complex zijn.
- Heel veel fragmenten
- aminozuur isomeren
- aminozuur isobaren
- massa dipeptiden
De eiwitsequentiebepaling kan in realtime
gedaan worden.
5. Gebruik van databases om eiwit te identificeren
o Peptidesequentieprobleem wordt database zoektocht probleem
o Verwachte eiwitfragmenten worden afgeleid van gesequeneerde genomen
2
, Proteoomanalyse
Er is dus een heel belangrijk verschil tussen naar 1 eiwit
kijken of naar heel veel eiwitten of maar een paar
eiwitten. Een western blot kan niet gebruikt worden
voor proteomics bv.
Bulk analyse
Eiwitidentificatie en/of- kwanitficatie van het volledie of gedeeltelijke protoom.
1. Untargeted / explorative / discovery proteomics
o Er zijn meerdere strategiën: we willen weten wat erin zit:
i. Bottom up (Shotgun proteomics): meest gebruikt
1. Eiwit wordt in peptiden geknipt
2. Peptiden worden gescheiden en gesequeneerd in MS
ii. Top down: snel maar moeilijk
1. Intact eiwit wordt in MS gebracht
2. Fragmenteren en fingerprinting in MS
3. Gebruikt MALDI-TOF → niet de AZ bepalen maar kleine peptiden
4. Goedkoper en sneller
iii. Voor sommige toepassingen: combinatie van bottom-up en top-down
o Meestal wel “bottom-up” want het heeft heel veel voordelen
i. Verhoogde strabiliteit en oplosbaarheid
ii. Grotere gevoeligheid
iii. Gemakkelijker te sequencen
iv. Minder posttranslationele modificaties per peptide
v. Eenvoudigere apperatuur
vi. Complexiteit van grotere eiwitten omwille van isotopen
2. Targeted proteomics
o Doel: analyse/kwantificatie van een vooraf bepaalde fractie van het proteoom
i. MS-based
Maakt gebruik van triple quadripoles (QQQ) in MRM (=SMR) modus →
multiple reaction monitoring = selectied reaction monitoring
→ sneller en kwantitatiever
2 grote groepen. Standaard → complexe peptiden mix gaat in Q1 → veel tijd.
Je weet in welke peptiden je interesse hebt → Q1 hierop aftellen → zodat je
enkel de gewenste peptiden kunt zien.
Indien ze gaan botsen → weet je welke fragmenten er gaan komen →
hierdoor kan je Q3 ook specifiek maken voor deze fragmenten.
ii. SOMAmer Aptamer-based protein array
Een SOMAmer bestaat uit een unike korte DNA sequentie met meerdere base
met gemodificeerde “protein-like” side chains. Aptameren kunnen dus
bepaalde vormen aanemenen – lijkt op een hybride tussen eiwit en DNA. En
elk aptamer herkent dan zo een specifiek eiwit in de natieve conformatie. Het
is een soort antistof die dan kan binden aan eiwit en dan ook aan DNA kan
hybridiseren.
3
Eiwitten zijn een hele grote complexe klasse van moleculen met heel grote verscheidenheid. De
verscheidenheid is zowel tussen de sequenties als in de structuren en de functies. De eiwitten
hebben een dynamische regeling (modificaties bv). Ze zijn direct betrokken bij fysiologie en
pathologie. Ze zijn hierdoor dus ook een interessante target voor therapie.
Sequentiebepaling
Edman degradatie
Er wordt een molecule toegevoegd aan het eiwit. Het molecule bestaat uit 2 delen:
aromatische ring die helpt om achteraf te kunnen detecteren en een reactieve groep
aan de N-terminus die gaat reageren bij een pH verandering → shuffeling van H+. Hierdoor gaat het
laatste AZ afgesplitst worden en dit kan zo herhaald worden om de AZ sequentie te bepalen.
Sequentiebepaling volgens Edman degradatie is erg omslachtig → 40-60 AZ per peptide.
Dit systeem is ondertussen geautomatieseerd en de eiwitsequenties worden opgeslagen in
databanken bv SWISS-PROT. De sequenties zijn vaak afgeleid van DNA. Maar de sequentiebepaling
wordt nu meer en meer gedaan met MS ipv Edman degradatie.
Eiwit sequentiebepaling via massa spectrometrie (MS)
Het eiwit moet eerst opgezuiverd worden met behulp van bepaalde proteasen kunnen de eiwitten
geknipt worden. Allemaal kleine peptiden die afkomstig zijn van hetzelfde eiwit.
MALDI-TOF: deze methoden gebruikt ionisering, de lading in deze methode is heel belangrijk. De
lading gaat de moleculen doen bewegen en gaat ook zorgen dat ze gedetecteerd kunnen worden.
Men gebruikt een matrix. Een laser gaat dan de matrix doen ioniseren zodat er bepaalde moleculen
uit het staal geschoten kunnen worden → komt dan in TOF (time of life) terecht.
Een buis falcon. De kleine moleculen gaan hier sneller in bewegen dan de grotere waardoor ze zo op
basis van grote gescheiden worden. Door de lading aanwezig kan zo de grote van het stukje peptide
bepaald worden. Deze data kunnen dan vergeleken worden met databanken om te bepalen welke
eiwitten aanwezig zijn.
Tandem-MS: ook een vorm van ionisatie. Elektro spray ionization. Vloietsof met een bepaalde druk
gaat door een buis gedaan worden waardoor er een soort spray ontstaat. De moleculen die hierdoor
gaan krijgen een bepaalde lading. De moleculen komen dan in het MS/MS systeem dat gebruik
maakt van een quadripool.
Quadripool = 4 metalen staven onder stroom die bepaalde stoffen doorlaten afhankelijk van de
stroom die erdoor gaat en afhankelijk van de lading kunnen ze erdoor of niet. 1ste is voor massa
bepaling vaak ook nog een collision cell → de eiwitten van de eerste gaan dan in stukken gebruoken
worden en dan gaat men kleine stukjes meten (kan tot op AZ niveau → meer info maar meer
omslachtig).
Werkwijze:
1. Eiwit knippen met protease (bij voorkeur Trypsine – knipt na een Arg)
o Endopeptidase → geeft fragmenten van <20 AZ
o Peptiden hebben een C-terminaal basisch residu
o Na ionisatie: 2 pos ladingen: NH2 C-terminaal → anders geknipt andere lading
eenvoudiger spectrum als alle peptiden een dubbele lading hebben
1
,2. Scheiding eiwitfragmenten
o Kolomchromatografie: vb reverse phase
o 2D elektroforese voor zeer complexe mengsels
o Verwijderen contaminanten (vb buffercomponenten:
detergenten, zouten)
o Directe koppeling met MS mogelijk
o Zeer kleine volumes volstaan
i. Microschaal HPLC
ii. Capillaire elektroforese
iii. Microvloeistof chips
3. MS van gescheiden peptiden
o Chromatografie direct koppelen aan MS
o Per tijdspint kan een m/z spectrum van peptiden worden
verkregen
o Clusters peptide isotopen worden zichtbaar
- MALDI/TOF
Resultaat = “handtekening” eiwit = verzending peptide massa’s
vergelijking ‘peptide mass fingerprint’ met verwachte peptide
massa’s uit databases
- MS/MS
Verdere fragmentatie in ‘collision cell’
4. Peptide fragmentatie in een botsongscel (enkel bij MS/MS) → AZ bepaling
o Botsing met inert gas (je kan zelf kiezen hoe hard ze botsen)
o Afhankelijk van de energie worden preferentieel bepaalde bindingen gesplitst
i. x,y,z: vanaf C-terminus
ii. a,b,c: vanaf N-terminus
iii. Subscript wijst op aantal AZ in fragment → Y1 = 1 AZ; Y2 = 2 AZ
iv. Y en B zijn de zwakste bindingen en daar heb je dus de meeste fragmenten
van → dit geeft hele complexe massacomplexen
o Sequentie peptide kan worden bepaald adhv spectrum
MS/MS spectra kunnen heel complex zijn.
- Heel veel fragmenten
- aminozuur isomeren
- aminozuur isobaren
- massa dipeptiden
De eiwitsequentiebepaling kan in realtime
gedaan worden.
5. Gebruik van databases om eiwit te identificeren
o Peptidesequentieprobleem wordt database zoektocht probleem
o Verwachte eiwitfragmenten worden afgeleid van gesequeneerde genomen
2
, Proteoomanalyse
Er is dus een heel belangrijk verschil tussen naar 1 eiwit
kijken of naar heel veel eiwitten of maar een paar
eiwitten. Een western blot kan niet gebruikt worden
voor proteomics bv.
Bulk analyse
Eiwitidentificatie en/of- kwanitficatie van het volledie of gedeeltelijke protoom.
1. Untargeted / explorative / discovery proteomics
o Er zijn meerdere strategiën: we willen weten wat erin zit:
i. Bottom up (Shotgun proteomics): meest gebruikt
1. Eiwit wordt in peptiden geknipt
2. Peptiden worden gescheiden en gesequeneerd in MS
ii. Top down: snel maar moeilijk
1. Intact eiwit wordt in MS gebracht
2. Fragmenteren en fingerprinting in MS
3. Gebruikt MALDI-TOF → niet de AZ bepalen maar kleine peptiden
4. Goedkoper en sneller
iii. Voor sommige toepassingen: combinatie van bottom-up en top-down
o Meestal wel “bottom-up” want het heeft heel veel voordelen
i. Verhoogde strabiliteit en oplosbaarheid
ii. Grotere gevoeligheid
iii. Gemakkelijker te sequencen
iv. Minder posttranslationele modificaties per peptide
v. Eenvoudigere apperatuur
vi. Complexiteit van grotere eiwitten omwille van isotopen
2. Targeted proteomics
o Doel: analyse/kwantificatie van een vooraf bepaalde fractie van het proteoom
i. MS-based
Maakt gebruik van triple quadripoles (QQQ) in MRM (=SMR) modus →
multiple reaction monitoring = selectied reaction monitoring
→ sneller en kwantitatiever
2 grote groepen. Standaard → complexe peptiden mix gaat in Q1 → veel tijd.
Je weet in welke peptiden je interesse hebt → Q1 hierop aftellen → zodat je
enkel de gewenste peptiden kunt zien.
Indien ze gaan botsen → weet je welke fragmenten er gaan komen →
hierdoor kan je Q3 ook specifiek maken voor deze fragmenten.
ii. SOMAmer Aptamer-based protein array
Een SOMAmer bestaat uit een unike korte DNA sequentie met meerdere base
met gemodificeerde “protein-like” side chains. Aptameren kunnen dus
bepaalde vormen aanemenen – lijkt op een hybride tussen eiwit en DNA. En
elk aptamer herkent dan zo een specifiek eiwit in de natieve conformatie. Het
is een soort antistof die dan kan binden aan eiwit en dan ook aan DNA kan
hybridiseren.
3
