RNA samenvatting

METHODEN: RNA
Zie methoden 1 voor verschillende methoden hoe RNA moet worden bereid voor deze verder te
kunnen gebruiken voor andere technieken.

RNA komt vooral enkelstrengig voor, terwijl DNA vooral enkel dubbelstrengig voorkomt, waardoor
RNA veel minder stabiel is dan DNA. RNAs bevatten ddNTPs en DNA bevatten dNTPs. RNA strengen
zijn in het algemeen veel korter dan DNA. RNA bevat een uracil in plaat van een thimidine.

Er zijn verschillende soorten RNA:

- DNA → RNA → eiwitten (mRNA, tRNA en rRNA nodig)
- Er is ook RNA dat niet omgezet wordt naar eiwitten (zowel lange als korte fragmenten)
o rRNAs en tRNAs helpen bij de translatie van eiwitten – zelf niet eiwit coderend
o miRNA → niet veel over gekend maar belangrijk bij gezondheid en ziekte
o piRNA = piwi-interacting RNA → interageert dus met piwi eiwitten → belangrijk bij
kiemcellen en dus bij de vruchtbaarheid
o siRNAs = small interfering RNA, short interfering RNA of silencing RNA → gebruikt als
methode voor het bestuderen van genexpressie
o lncRNAs = long noncoding RNA
o circulair RNA
▪ Belang van niet coderend RNA bij het gebruik van methoden
• Korter
• Geen poly-A-ataart
• In veel minder kopiën voorkomend in de cellen
• Aangepaste methoden nodig voor extractie en identificatie

Structuur van mRNA:

- De uiteinden van het mRNA liggen niet gecodeerd in het DNA, ze worden
toegevoegd/gemodificeerd
- 5’ cap = gemodificeerde G → methylgroep erop met een dubbele
fosfaatbrug
- 3’ poly A staart → een staart van een 50-250 tal A’s aan het uiteinde
- Pre-mRNA bestaat niet lang en is niet makkelijk te meten

Humaan genoom en transcriptoom

- ~20 000 genen
- ~200 000 transcripten
o Precieze aantal nog onzeker
o 50-100 000 proteïne conderend
o Veel niet coderend (lncRNA, miRNA…), pseudogenen
o Gen → vaak meedere transcripten door alternatieve splicing

Transcriptoomanalyse (transcriptomics)
Het doel van transcriptoom analyse = transcript(en) identificeren, genexpressie meten

- Targetgen(en() = te bepalen gen(en)/transcript(en)
- Bulk (=uit vele cellen samen) vs single cell (=individuele cellen)

1

, Er zijn verschillende methoden mogelijk:

1. Oudere methoden: Northern blot
o 1 gen – 1 transcript bepalen
o Duurt heel lang
o Bedoelt specifiek voor RNA
o Sample gaan laden in een gelleke en dan zo de lengte bepalen – deze dan overzetten
naar een papiertje en zo 1 gen bepalen voor 1 transcript
2. In situ (= op de plaats zelf) methoden (hybridizatie/PCR)
3. Kwantitiatieve PCR toepassingen (RT-PCR en ddPCR)
o Genexpressie kwantitatief
o Hoge throughput aantal stalen: 96-384 well PCR
o Enkele gekende transcripten in vele stalen
o Normale PCR = semi kwantitatief
▪ qPCR = de hoeveelheid van het staal
gaan bepalen en in real time
bepalen/bekijken
▪ dPCR = druppeltjes. In de druppeltjes elk apart een PCR reactie met probes
en primers voor al de verschillende transcripten
4. Micro-arrays
o Genexpressie kwantiatief
o Geel veel gekende transcripten, tot volledige transcriptoom
5. RNA-sequencing
o Genexpressie kwantiatief
o Heel veel transcripten, tot volledige transcriptoom
o Ook RNA sequentie aflezen, inclusief detectie ongekende transcripten
o Nu resolutie tot op niveau van individuele cellen

Transcriptomics : gaat over RNA analyse op grote schaal.

RNA (cDNA) micro-array
- Principe :
o RNA van staal wordt omgezet in gemerkt cDNA
o cDNA wordt gehybridiseerd met array die probes bevat voor verschillende (alle)
genen
o RNAs geëxprimeerd in staal geven een signaal op de array
o Miniaturiseerbaar → vele assays in parallel
- Nu: kant-en-klare-array
- cDNA microarrays
o probe = 1 labg cDNA molecule (600-2400 nt) of meerdere lange
oligonucleotides (70-80 nt) per gen (long-nucleotide microarray)
o probe gespot op vaste fase (microarray)
- high-density oligonucleotide microaarys:
o probe = meerdere korte oligonucleotides (~25-50 nt) per gen
o probe in situ aangemaakt op vaste fase (microarray)
o Eventueel controles:
▪ Match en mismatch probe
▪ Normalizatie-probes
▪ Replicatie-probes

2