Samenvatting moleculair biologische technieken
Per leerdoel staat er een uitleg, maar de leerdoelen staan niet in de volgorde van de lessen maar van
het blokboek en sommige leerdoelen zijn samengevoegd voor een beter lopend geheel.
Het proces om nucleïnezuren te isoleren uit cellen:
Er zijn 2 strategieën om nucleïnezuren uit cellen te isoleren:
1. Alles verwijderen op het DNA/RNA na.
Deze strategie bestaat uit een aantal stappen:
De cellen kapot maken m.b.v. een lysis mix(deze stap ook voor strategie 2), deze lysis mix
bestaat uit:
Lysozym: een enzym dat de celwand afbreekt
Ethylenediaminetetraacetaat(EDTA): een chelator die de celwand instabiel maakt
Sodium dodecyl sulfaat(SDS): een detergens dat zorgt voor het neerslaan van eiwitten en dat
de membranen oplossen.
Na toevoegen van een lysis mix is er een celaxtract dat moet worden afgedraaid, waarbij het
DNa, RNA, eiwitten en zouten in het supernatant en de membranen en de rest zit in het
pellet.
Het supernatant wordt overgebracht in een nieuwe buis, en daarbij wordt fenol toegevoegd
zodat de eiwitten neerslaan.
Als dit eenmaal is afgedraaid heb je een waterlaag, een interface en een fenollaag.
De waterlaag wordt overgebracht in een
nieuwe buis, waarbij ethanol in een
behaalde verhouding moet worden
toegevoegd, en RNase/DNase.
Na afdraaien, is het DNA/RNA
neergeslagen.
2. Selectief DNA/RNA vissen.
Deze strategie is een ionenuiwisselingschromatografie, dit is scheiding doordat geladen deeltjes
binden aan een chromatografiesche hars kolom:
Het celextract wordt toegevoegd aan de kolom.
Al negatief geladen onderdelen van het celextract blijven aan de hars
plakken(DNA, RNA en sommige eiwitten).
Door toevoeging van zouten laten sommige zwakkere geladen
moleculen los van de hars.
Er worden 2 zout oplossingen gebruikt:
1. Een zout oplossing van 1,00M NaCl met een pH 7,0 waardoor RNA en
eiwitten loslaten.
2. Een zout oplossing van 1,25M NaCl met een pH 8,5 waardoor DNA
loslaat en apart kan worden opgevangen.
Voor plasmide DNA moet er een NaOH zout worden toegevoegd totdat de pH 12 is, en dat heb je het
plasmide in het supernatant.
, Het verschil tussen RNA en DNA isolatie:
Het verschil tussen DNA en RNA isolatie is het gebruikt van enzymen(RNase/DNase), en RNA is zeer
instabiel en moet ook koud bewaard worden(-80 oC). Er moeten ook een aantal dingen aan worden
toegevoegd: TRIZOL, DEPC, en RNase inhibitoren.
Hoe DNA en RNA er uitzien op een gel:
Afhankelijk van wat het hoofdproduct is(DNA of RNA), als het een gel is voor DNA zal het RNA een
smeer vormen omdat het RNA niet is geknipt en het DNA wel. En natuurlijk andersom dat hetDNA
een smeer vormt en het RNA bandjes.
Het verschil tussen een agarose gel en een PAGE:
Verschil: Agarose gel: Polyacrylamide gel electroforese:(PAGE)
Bestandsdelen: Agarose Polyacrylamide
Doel: DNA scheiden op grote DNA scheiden op grote van een enkel base, maar
meestal voor immunologisch onderzoek
Wat een ligase is, en waar het voor gebruikt wordt:
Een ligase is een enzym dat moleculen aan elkaar verbindt. Een DNA ligase is een
enzym dat zich bezig houdt met het aan elkaar plakken van stukjes DNA, in een
cel is het meestal dat maar 1 streng verbonden moet worden(bijvoorbeeld bij de
DNA replicatie)maar het verbindt ook stukken dubbel strengs DNA aan elkaar.
DNA ligase werkt door aan de 3’OH-groep van een (deoxy)ribose een
5’fosfaatgroep te plakken.
In vivo(cellen) is het meestal dat er 1 streng wordt geplakt, en in vitro (kunstmatig)worden er
meestal 2 strengen geplakt.
Met hybridisatie van DNA strengen(sticky ends) is het makkelijker voor ligase om z’n werk te doen.
Bij blunt ends is het moeilijker om te ligeren omdat de uiteinden toevallig bij elkaar moeten komen,
maar een voordeel is wel dat het altijd compatibel is.
Verschillende soorten nucleasen:
Nucleases: Functie:
Exonucleases Knipt nucleotiden aan de uiteinden van DNA
Endonucleases Knipt nucleotiden binnen in het DNA
DNA nucleases Knipt DNA nucleotiden
RNA nucleases Knipt RNA nucleotiden
ss nulceases Knipt enkelstrengs
ds nucleases Knipt dubbelstrengs
Specifieke nucleases Knipt op een specifieke seqeuntie (herkenningssequentie)
Aspecifieke nucleases Knipt zonder een herkenningssequentie
3 types endonulceases:
1. Knipt vlak bij een herkenningssequentie
2. Knipt in de herkenningssequentie
3. Knipt ver buiten een herkenningssequentie
Per leerdoel staat er een uitleg, maar de leerdoelen staan niet in de volgorde van de lessen maar van
het blokboek en sommige leerdoelen zijn samengevoegd voor een beter lopend geheel.
Het proces om nucleïnezuren te isoleren uit cellen:
Er zijn 2 strategieën om nucleïnezuren uit cellen te isoleren:
1. Alles verwijderen op het DNA/RNA na.
Deze strategie bestaat uit een aantal stappen:
De cellen kapot maken m.b.v. een lysis mix(deze stap ook voor strategie 2), deze lysis mix
bestaat uit:
Lysozym: een enzym dat de celwand afbreekt
Ethylenediaminetetraacetaat(EDTA): een chelator die de celwand instabiel maakt
Sodium dodecyl sulfaat(SDS): een detergens dat zorgt voor het neerslaan van eiwitten en dat
de membranen oplossen.
Na toevoegen van een lysis mix is er een celaxtract dat moet worden afgedraaid, waarbij het
DNa, RNA, eiwitten en zouten in het supernatant en de membranen en de rest zit in het
pellet.
Het supernatant wordt overgebracht in een nieuwe buis, en daarbij wordt fenol toegevoegd
zodat de eiwitten neerslaan.
Als dit eenmaal is afgedraaid heb je een waterlaag, een interface en een fenollaag.
De waterlaag wordt overgebracht in een
nieuwe buis, waarbij ethanol in een
behaalde verhouding moet worden
toegevoegd, en RNase/DNase.
Na afdraaien, is het DNA/RNA
neergeslagen.
2. Selectief DNA/RNA vissen.
Deze strategie is een ionenuiwisselingschromatografie, dit is scheiding doordat geladen deeltjes
binden aan een chromatografiesche hars kolom:
Het celextract wordt toegevoegd aan de kolom.
Al negatief geladen onderdelen van het celextract blijven aan de hars
plakken(DNA, RNA en sommige eiwitten).
Door toevoeging van zouten laten sommige zwakkere geladen
moleculen los van de hars.
Er worden 2 zout oplossingen gebruikt:
1. Een zout oplossing van 1,00M NaCl met een pH 7,0 waardoor RNA en
eiwitten loslaten.
2. Een zout oplossing van 1,25M NaCl met een pH 8,5 waardoor DNA
loslaat en apart kan worden opgevangen.
Voor plasmide DNA moet er een NaOH zout worden toegevoegd totdat de pH 12 is, en dat heb je het
plasmide in het supernatant.
, Het verschil tussen RNA en DNA isolatie:
Het verschil tussen DNA en RNA isolatie is het gebruikt van enzymen(RNase/DNase), en RNA is zeer
instabiel en moet ook koud bewaard worden(-80 oC). Er moeten ook een aantal dingen aan worden
toegevoegd: TRIZOL, DEPC, en RNase inhibitoren.
Hoe DNA en RNA er uitzien op een gel:
Afhankelijk van wat het hoofdproduct is(DNA of RNA), als het een gel is voor DNA zal het RNA een
smeer vormen omdat het RNA niet is geknipt en het DNA wel. En natuurlijk andersom dat hetDNA
een smeer vormt en het RNA bandjes.
Het verschil tussen een agarose gel en een PAGE:
Verschil: Agarose gel: Polyacrylamide gel electroforese:(PAGE)
Bestandsdelen: Agarose Polyacrylamide
Doel: DNA scheiden op grote DNA scheiden op grote van een enkel base, maar
meestal voor immunologisch onderzoek
Wat een ligase is, en waar het voor gebruikt wordt:
Een ligase is een enzym dat moleculen aan elkaar verbindt. Een DNA ligase is een
enzym dat zich bezig houdt met het aan elkaar plakken van stukjes DNA, in een
cel is het meestal dat maar 1 streng verbonden moet worden(bijvoorbeeld bij de
DNA replicatie)maar het verbindt ook stukken dubbel strengs DNA aan elkaar.
DNA ligase werkt door aan de 3’OH-groep van een (deoxy)ribose een
5’fosfaatgroep te plakken.
In vivo(cellen) is het meestal dat er 1 streng wordt geplakt, en in vitro (kunstmatig)worden er
meestal 2 strengen geplakt.
Met hybridisatie van DNA strengen(sticky ends) is het makkelijker voor ligase om z’n werk te doen.
Bij blunt ends is het moeilijker om te ligeren omdat de uiteinden toevallig bij elkaar moeten komen,
maar een voordeel is wel dat het altijd compatibel is.
Verschillende soorten nucleasen:
Nucleases: Functie:
Exonucleases Knipt nucleotiden aan de uiteinden van DNA
Endonucleases Knipt nucleotiden binnen in het DNA
DNA nucleases Knipt DNA nucleotiden
RNA nucleases Knipt RNA nucleotiden
ss nulceases Knipt enkelstrengs
ds nucleases Knipt dubbelstrengs
Specifieke nucleases Knipt op een specifieke seqeuntie (herkenningssequentie)
Aspecifieke nucleases Knipt zonder een herkenningssequentie
3 types endonulceases:
1. Knipt vlak bij een herkenningssequentie
2. Knipt in de herkenningssequentie
3. Knipt ver buiten een herkenningssequentie
