Primaire Artikel 3: Identification of genes associated with cortical malformation using a transposon-mediated somatic
mutagenesis screen in mice – Lu et al., 2018
Centrale vraag:
• Kunnen we nieuwe genen identificeren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de cortex en de pathogenese van malformaties van
corticale ontwikkeling (MCD), door gebruik te maken van somatische mutagenese met piggyBac-transposons tijdens embryonale
hersenontwikkeling?
• Is het mogelijk om via in utero transposon-mutagenese een forward-genetische screen te ontwikkelen die onbekende MCD-genen onthult,
en komen deze genen overeen met mutaties die worden gevonden in menselijke FCD-patiënten?
Belangrijkste bevindingen:
• Nieuwe genetische screeningmethode werkt effectief:
o De auteurs ontwikkelden een in vivo forward-genetische screen door: piggyBac-transposons + transposase (PBase) en in utero
electroporatie in RGC’s op E14.5
o Transposon-inserties veroorzaken somatische mutaties in neurale voorlopercellen.
o Mutante neuronen die niet goed migreren, blijven ectopisch in de white matter hangen → deze cellen worden geïsoleerd en
geanalyseerd.
o Belangrijk: Deze methode maakt snelle identificatie van genen mogelijk die neuronale migratie verstoren.
• De screen identificeert 33 kandidaat-genen voor MCD:
o Splinkerette-PCR (spPCR) + sequencing van inserties in ectopische neuronen leverde 33 genen op.
o Deze genen liggen in pathways voor: neuronale ontwikkeling, celmigratie, celadhesie en embryonale morfogenese
o Conclusie: De screen levert biologisch relevante genen op die passen bij bekende MCD-mechanismen.
• Functionele validatie bevestigt dat de meeste genen essentieel zijn:
o Knockdown (shRNA) van 25 kandidaten → 19 van de 25 veroorzaakten migratiestoornissen.
o Knockdown van uitgesloten genen → geen of milde effecten (goede controle).
o Overexpressie van shRNA-resistente cDNA’s → rescue van het fenotype.
o CRISPR/Cas9-disruptie van 3 topgenen (Cep152, Cntn1, Dscam) → opnieuw migratiestoornissen.
o Conclusie: De meerderheid van de gescreende genen is functioneel belangrijk voor corticale ontwikkeling.
• Klinische relevantie: mutaties in FCD-patiënten overlappen met de kandidaat-genen:
o Whole-exome sequencing van hersenweefsel van FCD type II patiënten identificeerde somatische mutaties in: CEP152, CNTN1,
DSCAM, FAT3, LPP, TRAPPC9
o Drie hiervan (CEP152, CNTN1, DSCAM) waren ook functioneel gevalideerd in muizen.
o Belangrijk: Mutant CEP152 (p.Cys1262Phe) kon het knockdown-fenotype niet redden → loss-of-function.
o Conclusie: De kandidaat-genen zijn niet alleen belangrijk in muizen, maar ook klinisch relevant voor menselijke MCD/FCD.
• De methode is snel, krachtig en toepasbaar voor neurodevelopmental genetics:
o Voordelen: snelle identificatie van genen (weken i.p.v. maanden/jaren), geen noodzaak voor het genereren van volledige knock-out
muizen en hoge mutatiefrequentie in één dier
o De methode kan worden gebruikt voor: het ontdekken van nieuwe MCD-genen (screenen), het bestuderen van neuronale migratie en
het koppelen van somatische mutaties aan ontwikkelingsstoornissen
Introductie:
Corticale ontwikkeling is complex en genetisch kwetsbaar:
• De ontwikkeling van de cortex verloopt via meerdere overlappende stappen tijdens de embryonale fase.
• Neuro-epitheliale cellen (NEPs) → radiale glia (RGCs) → productie van nieuwe neuronen.
• Neuronen migreren vanuit de ventriculaire zone (VZ) langs radiale vezels naar de corticale plaat (CP).
• Dit proces vereist precise genetische regulatie.
• Verstoring leidt tot malformaties van corticale ontwikkeling (MCDs) → epilepsie, ontwikkelingsachterstand, autisme.
1
,Bekende genetische oorzaken van MCD’s:
• Microcefalie: MCPH1, ASPM, CPAP, CDK5RAP2, STIL.
• Lissencefalie: LIS1, DCX, ARX, TUBA1A.
• Double cortex: DCX.
• Periventriculaire heterotopie: ARFGEF2.
• Tuberous sclerosis: TSC1, TSC2.
• Recent: somatische mutaties in mTOR-pathway → focal cortical dysplasia (FCD).
• Maar: veel genetische oorzaken blijven onbekend.
Waarom nieuwe methoden nodig zijn:
• Klassieke genetische screens zijn traag of inefficiënt in zoogdieren.
• Veel MCD-genen zijn nog niet ontdekt.
• Somatische mutaties (alleen in hersencellen) zijn moeilijk te identificeren met traditionele genetica.
PiggyBac-transposons als oplossing:
• Transposons kunnen willekeurig in het genoom springen → mutaties veroorzaken.
• PiggyBac (PB) is zeer mobiel in zoogdiercellen en makkelijk te traceren (kan slechts éénmaal hoppen) .
• Ideaal voor forward genetic screens.
Nieuwe aanpak van deze studie:
• De auteurs gebruiken in utero electroporatie op E14.5 om PB-transposons in RGC’s te brengen.
• Hierdoor ontstaan somatische mutaties in neurale voorlopercellen.
• Neuronen met migratiestoornissen blijven ectopisch in de white matter hangen.
• Deze cellen worden geïsoleerd → inserties worden geïdentificeerd → kandidaatgenen worden gevonden.
Validatie van kandidaatgenen:
• RNAi-knockdown en CRISPR/Cas9-disruptie tonen dat veel van deze genen essentieel zijn voor neuronale migratie.
• Bio-informatica bevestigt dat de genen betrokken zijn bij ontwikkeling en neurobiologie.
Klinische relevantie:
• Whole-exome sequencing van hersenweefsel van FCD-patiënten toont somatische mutaties in dezelfde genen.
• Dit koppelt de muis-screen direct aan menselijke ziekte.
Kernboodschap van de introductie:
• Corticale ontwikkeling is genetisch kwetsbaar en veel MCD-genen zijn nog onbekend.
• PiggyBac-gebaseerde somatische mutagenese biedt een krachtige manier om nieuwe genen te identificeren.
• Deze methode kan zowel fundamentele ontwikkelingsbiologie als klinische neurogenetica vooruithelpen.
Een diermodel van MCD door middel van transposon-insertiemutagenese:
Waarom dit experiment?
• Centrale vraag: Kunnen we een in vivo systeem ontwikkelen dat willekeurige mutaties introduceert in corticale progenitorcellen, zodat we
genen kunnen identificeren die essentieel zijn voor neuronale migratie en corticale ontwikkeling?
• Waarom belangrijk?
o Veel MCD-genen zijn nog onbekend.
o Neuronale migratie is een cruciaal, maar kwetsbaar proces.
o Een forward-genetische screen in muizen bestond nog niet voor corticale ontwikkeling.
o Als mutaties migratie verstoren, blijven neuronen ectopisch in de white matter hangen → ideaal selectiesignaal.
2
, Figuur 1A–B: Concept van de transposon-screen
• Deelvraag:
o Hoe kan piggyBac-mutagenese worden ingezet
om migratiestoornissen zichtbaar te maken?
• Proefopzet:
o In utero electroporatie op E14.5.
o Injectie van:
▪ piggyBac-transposon (PB)
▪ transposase (PBase)
o Inserties in RGC’s → mutaties in alle dochtercellen.
o Analyse op P10.
• Resultaten:
o Mutaties die migratie verstoren zorgen dat neuronen in VZ/SVZ blijven hangen.
o Dit creëert een duidelijk fenotype om mutante cellen te isoleren.
Met opmerkingen [CZ1]: GFP is transiente transfectie
(niet ingebouwd in genoom) -> in oudere neuronen en
• Interpretatie: Glia-cellen geen GFP meer
o Het systeem werkt als een functionele selectie: alleen mutaties die migratie beïnvloeden worden zichtbaar.
Rood signaal komt door ingebouwd transposon in
Figuur 1C–D: Normale migratie vs. mutante migratie
genoom -> rood blijft aanwezig
• Deelvraag:
o Wat is het verschil in neuronale distributie
tussen controle en PB-mutagenese?
• Proefopzet:
o pCAG-GFP (controle) (groen)
o PB alleen (geel)
o PB + PBase (actieve mutagenese) (rood)
o Analyse van gelabelde cellen op P10.
• Resultaten:
o Controle en PB-alleen → neuronen bereiken normaal laag 2/3 en 4.
o PB + PBase → extra populatie RFP+ cellen in white matter.
o Deze ectopische cellen zijn multipolair en lijken op immature neuronen.
• Interpretatie:
o Actieve transposon-mutagenese veroorzaakt migratiestoornissen.
o De ectopische cellen zijn kandidaat-mutanten.
Figuur 1E: Zijn de ectopische cellen echt neuronen?
• Deelvraag:
o Zijn de RFP+ cellen in de white matter neuronen die
vastgelopen zijn, of glia?
• Proefopzet:
o Co-electroporatie van:
▪ PB + PBase (RFP)
▪ pCAG-GFP (labelt alleen vroeg-geboren neuronen)
o Analyse van GFP/RFP dubbele cellen.
• Resultaten:
o Sommige GFP+/RFP+ cellen bevinden zich ectopisch in de white matter.
o Dit bewijst dat het neuronen zijn die niet goed migreerden.
• Interpretatie:
o De ectopische populatie bestaat uit postmitotische neuronen, niet glia.
o Mutaties verstoren dus neurale migratie, niet gliale ontwikkeling.
3
mutagenesis screen in mice – Lu et al., 2018
Centrale vraag:
• Kunnen we nieuwe genen identificeren die betrokken zijn bij de ontwikkeling van de cortex en de pathogenese van malformaties van
corticale ontwikkeling (MCD), door gebruik te maken van somatische mutagenese met piggyBac-transposons tijdens embryonale
hersenontwikkeling?
• Is het mogelijk om via in utero transposon-mutagenese een forward-genetische screen te ontwikkelen die onbekende MCD-genen onthult,
en komen deze genen overeen met mutaties die worden gevonden in menselijke FCD-patiënten?
Belangrijkste bevindingen:
• Nieuwe genetische screeningmethode werkt effectief:
o De auteurs ontwikkelden een in vivo forward-genetische screen door: piggyBac-transposons + transposase (PBase) en in utero
electroporatie in RGC’s op E14.5
o Transposon-inserties veroorzaken somatische mutaties in neurale voorlopercellen.
o Mutante neuronen die niet goed migreren, blijven ectopisch in de white matter hangen → deze cellen worden geïsoleerd en
geanalyseerd.
o Belangrijk: Deze methode maakt snelle identificatie van genen mogelijk die neuronale migratie verstoren.
• De screen identificeert 33 kandidaat-genen voor MCD:
o Splinkerette-PCR (spPCR) + sequencing van inserties in ectopische neuronen leverde 33 genen op.
o Deze genen liggen in pathways voor: neuronale ontwikkeling, celmigratie, celadhesie en embryonale morfogenese
o Conclusie: De screen levert biologisch relevante genen op die passen bij bekende MCD-mechanismen.
• Functionele validatie bevestigt dat de meeste genen essentieel zijn:
o Knockdown (shRNA) van 25 kandidaten → 19 van de 25 veroorzaakten migratiestoornissen.
o Knockdown van uitgesloten genen → geen of milde effecten (goede controle).
o Overexpressie van shRNA-resistente cDNA’s → rescue van het fenotype.
o CRISPR/Cas9-disruptie van 3 topgenen (Cep152, Cntn1, Dscam) → opnieuw migratiestoornissen.
o Conclusie: De meerderheid van de gescreende genen is functioneel belangrijk voor corticale ontwikkeling.
• Klinische relevantie: mutaties in FCD-patiënten overlappen met de kandidaat-genen:
o Whole-exome sequencing van hersenweefsel van FCD type II patiënten identificeerde somatische mutaties in: CEP152, CNTN1,
DSCAM, FAT3, LPP, TRAPPC9
o Drie hiervan (CEP152, CNTN1, DSCAM) waren ook functioneel gevalideerd in muizen.
o Belangrijk: Mutant CEP152 (p.Cys1262Phe) kon het knockdown-fenotype niet redden → loss-of-function.
o Conclusie: De kandidaat-genen zijn niet alleen belangrijk in muizen, maar ook klinisch relevant voor menselijke MCD/FCD.
• De methode is snel, krachtig en toepasbaar voor neurodevelopmental genetics:
o Voordelen: snelle identificatie van genen (weken i.p.v. maanden/jaren), geen noodzaak voor het genereren van volledige knock-out
muizen en hoge mutatiefrequentie in één dier
o De methode kan worden gebruikt voor: het ontdekken van nieuwe MCD-genen (screenen), het bestuderen van neuronale migratie en
het koppelen van somatische mutaties aan ontwikkelingsstoornissen
Introductie:
Corticale ontwikkeling is complex en genetisch kwetsbaar:
• De ontwikkeling van de cortex verloopt via meerdere overlappende stappen tijdens de embryonale fase.
• Neuro-epitheliale cellen (NEPs) → radiale glia (RGCs) → productie van nieuwe neuronen.
• Neuronen migreren vanuit de ventriculaire zone (VZ) langs radiale vezels naar de corticale plaat (CP).
• Dit proces vereist precise genetische regulatie.
• Verstoring leidt tot malformaties van corticale ontwikkeling (MCDs) → epilepsie, ontwikkelingsachterstand, autisme.
1
,Bekende genetische oorzaken van MCD’s:
• Microcefalie: MCPH1, ASPM, CPAP, CDK5RAP2, STIL.
• Lissencefalie: LIS1, DCX, ARX, TUBA1A.
• Double cortex: DCX.
• Periventriculaire heterotopie: ARFGEF2.
• Tuberous sclerosis: TSC1, TSC2.
• Recent: somatische mutaties in mTOR-pathway → focal cortical dysplasia (FCD).
• Maar: veel genetische oorzaken blijven onbekend.
Waarom nieuwe methoden nodig zijn:
• Klassieke genetische screens zijn traag of inefficiënt in zoogdieren.
• Veel MCD-genen zijn nog niet ontdekt.
• Somatische mutaties (alleen in hersencellen) zijn moeilijk te identificeren met traditionele genetica.
PiggyBac-transposons als oplossing:
• Transposons kunnen willekeurig in het genoom springen → mutaties veroorzaken.
• PiggyBac (PB) is zeer mobiel in zoogdiercellen en makkelijk te traceren (kan slechts éénmaal hoppen) .
• Ideaal voor forward genetic screens.
Nieuwe aanpak van deze studie:
• De auteurs gebruiken in utero electroporatie op E14.5 om PB-transposons in RGC’s te brengen.
• Hierdoor ontstaan somatische mutaties in neurale voorlopercellen.
• Neuronen met migratiestoornissen blijven ectopisch in de white matter hangen.
• Deze cellen worden geïsoleerd → inserties worden geïdentificeerd → kandidaatgenen worden gevonden.
Validatie van kandidaatgenen:
• RNAi-knockdown en CRISPR/Cas9-disruptie tonen dat veel van deze genen essentieel zijn voor neuronale migratie.
• Bio-informatica bevestigt dat de genen betrokken zijn bij ontwikkeling en neurobiologie.
Klinische relevantie:
• Whole-exome sequencing van hersenweefsel van FCD-patiënten toont somatische mutaties in dezelfde genen.
• Dit koppelt de muis-screen direct aan menselijke ziekte.
Kernboodschap van de introductie:
• Corticale ontwikkeling is genetisch kwetsbaar en veel MCD-genen zijn nog onbekend.
• PiggyBac-gebaseerde somatische mutagenese biedt een krachtige manier om nieuwe genen te identificeren.
• Deze methode kan zowel fundamentele ontwikkelingsbiologie als klinische neurogenetica vooruithelpen.
Een diermodel van MCD door middel van transposon-insertiemutagenese:
Waarom dit experiment?
• Centrale vraag: Kunnen we een in vivo systeem ontwikkelen dat willekeurige mutaties introduceert in corticale progenitorcellen, zodat we
genen kunnen identificeren die essentieel zijn voor neuronale migratie en corticale ontwikkeling?
• Waarom belangrijk?
o Veel MCD-genen zijn nog onbekend.
o Neuronale migratie is een cruciaal, maar kwetsbaar proces.
o Een forward-genetische screen in muizen bestond nog niet voor corticale ontwikkeling.
o Als mutaties migratie verstoren, blijven neuronen ectopisch in de white matter hangen → ideaal selectiesignaal.
2
, Figuur 1A–B: Concept van de transposon-screen
• Deelvraag:
o Hoe kan piggyBac-mutagenese worden ingezet
om migratiestoornissen zichtbaar te maken?
• Proefopzet:
o In utero electroporatie op E14.5.
o Injectie van:
▪ piggyBac-transposon (PB)
▪ transposase (PBase)
o Inserties in RGC’s → mutaties in alle dochtercellen.
o Analyse op P10.
• Resultaten:
o Mutaties die migratie verstoren zorgen dat neuronen in VZ/SVZ blijven hangen.
o Dit creëert een duidelijk fenotype om mutante cellen te isoleren.
Met opmerkingen [CZ1]: GFP is transiente transfectie
(niet ingebouwd in genoom) -> in oudere neuronen en
• Interpretatie: Glia-cellen geen GFP meer
o Het systeem werkt als een functionele selectie: alleen mutaties die migratie beïnvloeden worden zichtbaar.
Rood signaal komt door ingebouwd transposon in
Figuur 1C–D: Normale migratie vs. mutante migratie
genoom -> rood blijft aanwezig
• Deelvraag:
o Wat is het verschil in neuronale distributie
tussen controle en PB-mutagenese?
• Proefopzet:
o pCAG-GFP (controle) (groen)
o PB alleen (geel)
o PB + PBase (actieve mutagenese) (rood)
o Analyse van gelabelde cellen op P10.
• Resultaten:
o Controle en PB-alleen → neuronen bereiken normaal laag 2/3 en 4.
o PB + PBase → extra populatie RFP+ cellen in white matter.
o Deze ectopische cellen zijn multipolair en lijken op immature neuronen.
• Interpretatie:
o Actieve transposon-mutagenese veroorzaakt migratiestoornissen.
o De ectopische cellen zijn kandidaat-mutanten.
Figuur 1E: Zijn de ectopische cellen echt neuronen?
• Deelvraag:
o Zijn de RFP+ cellen in de white matter neuronen die
vastgelopen zijn, of glia?
• Proefopzet:
o Co-electroporatie van:
▪ PB + PBase (RFP)
▪ pCAG-GFP (labelt alleen vroeg-geboren neuronen)
o Analyse van GFP/RFP dubbele cellen.
• Resultaten:
o Sommige GFP+/RFP+ cellen bevinden zich ectopisch in de white matter.
o Dit bewijst dat het neuronen zijn die niet goed migreerden.
• Interpretatie:
o De ectopische populatie bestaat uit postmitotische neuronen, niet glia.
o Mutaties verstoren dus neurale migratie, niet gliale ontwikkeling.
3
