Samenvatting An Introduction to Genetic Analysis, ISBN: 9781319114770 GEN-11806 Fundamentals Of Genetics And Molecular Biology (GEN-11806)

Fundamentals of Genetics

Chapter 8
Fenotype: veroorzaakt door veranderingen (mutaties) in DNA
Verschillen DNA tot uitdrukking: transcriptie en translatie

Structuur RNA
Uracil ipv thymine
Ribose ipv deoxyribose
 DNA: alleen 3’ OH
 RNA: ook 2’ OH
1 streng: kan waterstofbruggen vormen met andere delen van dezelfde streng
 Stems (dubbelstengs)
 Loops (enkelstrengs, binding eiwitten)

Transcriptie in eukaryoten
1. 2% van het DNA is eiwit coderend
2. RNA polymerase I, II en III
3. Transcriptie vindt plaats in kern
4. DNA is verpakt met eiwitten tot chromatine
GTF’s (general transcriptie factors) brengen RNA polymerase naar start transcriptie

OH aan 3’
Fosfaat aan 5’
Alleen nucleotide aan 3’ OH: RNA groeit van 5’-3’
1 van 2 DNA strengen gebruikt als template

Hoe weet RNA polymerase waar hij moet beginnen?
TATA box – TATA box binding protein
 Kristallisatiepunt andere eiwitten
 RNA polymerase kan hierin landen
CTD verandert steeds: andere eiwitten kunnen binden – RNA processing

mRNA processing
 Capping
M7G: gemethyleerd guanine
Tijdens transcriptie – ongeveer 25 nucleotiden
Bescherming RNA
Bindingsplek voor eiwitten
 Polyadenylation
Einde: RNA polymerase schrijft iets te veel over – wordt afgeknipt
Lange staart A nucleotiden door eiwitten
Bescherming RNA
 Splicing
Introns worden uit pre-mRNA gehaald
Dmv snRNAs: base paring met mRNA rondom introns
Splice site: begint met GU en eindigt met AG
Hulp andere eiwitten -> spliceosome knipt in het RNA (katalytische activiteit)
 Alternative splicing
Verschillende manier aan elkaar knopen exons -> verschillende eiwitten
Exon skipping

,Afbraak mRNA
1. Poly(A) staart en cap worden afbgebroken door eiwitten: mRNA gevoeliger voor afbraak
Afbraak van 5’ -> 3’ en 3’ -> 5’
2. Small interfering RNAs (siRNAs)
Dubbelstrengs RNA moleculen wordt afgebroken door de cel
siRNA past op stuk RNA -> dubbelstrengs
Dicer eiwitcomplex herkent dubbelstrengs RNA – breekt het af tot stukjes van 21 nucleotiden
Beschermt cel tegen lichaamsvreemd DNA (viraal DNA)

RNA interferentie
Dubbelstrengs RNA: gericht RNA vernietigen
Mutaties maken – rol genen in organisme

, Chapter 10
1. RNA isoleren: zonder intronen – mRNA als template
2. Primer tegenaan zetten – reverse transcriptase: RNA -> DNA
3. mRNA afbreken – elkele streng DNA
4. Nieuwe primer met ligase tegenaan zetten
5. DNA polymerase maakt dubbelstrengs DNA
Nucleotidesequentie aan primer: restrictie enzym knipt een deel af -> losse uiteinden
complementair aan ander DNA

Plasmide: extra DNA in bacterie
Losse uiteinden – ander DNA aan plakken -> recombinant DNA molecuul
Plasmide:
 Origin of replication
 Cloning site met herkenningssite restrictie enzymen
 Selectie marker: gen dat codeert voor eiwit om antbiotica af te breken
 lacZ met polylinker: kleurt wanneer niet gerecombineerd

PCR
1. Primer op template DNA
2. Denaturatie bij 96 graden (DNA polymerase denatureert)
3. Strengen uit elkaar
4. Primers kunnen binden bij 60 graden
5. Taq polymerase synthetiseert DNA
6. Weer denatureren: nieuwe primers
7. Streng wordt weer verdubbeld
8. DNA scheiden op gel
9. Kleurstof toevoegen: zien waar DNA aanwezig is

DNA sequencing:
Dideoxy sequencing
DNA polymerase heeft OH nodig voor toevoeging volgend
nucleotide
Nucleotiden zonder OH (ddNTP): polymerase
stopt
Geautomatiseerd: fluorescente
dideoxyducleotide labels

Genetic engineering:
1. In vesikels
2. Inspuiten
3. Dmv virussen

CRISPR-Cas9
In bacterie gebruikt om binnendringers te
vernietigen
Stukjes RNA wordt herkend door bacteire en
afgebroken door Cas9
Cas9: kan midden in DNA knippen
1. 20 nucleotiden synthetiseren vooraf aan
plek wat je wil veranderen
2. Cloneren, overgeschreven tot single
guide RNA