02 - 04 / Introductie NGS
NGS ofwel, next generation sequencing, valt onder genomics. Het aantal nucleotiden van
het humane genoom is 3,000,000,000. Er zijn 20,000 humane genen die gemiddeld 10-15
kb groot zijn, maar hierin zit grote variatie. Per zoogdiercel zit er 10pg DNA.
Met DNA sequencing verkrijg je de sequentie van nucleotiden van een organisme haar
genoom. Eerst neem je een sample hiervan DNA extraheren, library of DNA fragments
ofwel voorbereiden en vervolgens sequencen. Sequencen ging vroeger middels radioactief
labelen van nucleotiden, elektroforese en vervolgens handmatig interpreteren dit werd
geautomatiseerd. Illumina is nu de grootste in sequencing apparaten, zij maken het
mogelijk gehele genomen van individuen of populaties te meten. Er zijn vele toepassingen
voor sequencing zoals variant detection, splice variant detection, RNA-seq
etc.
Bij sanger sequencing sequence je 1 molecuul DNA tegelijk, je voegt voor
PCR nucleotiden toe die de elongatie stoppen waardoor de polymerase reactie
stopt. Dit gebeurt per nucleotide, dus in 4 buisjes. Vervolgens laat je dit runnen
over een gel en kan je van onder naar boven lezen wat de sequentie is.
High-throughput sequencing zoals NGS en MPS. Eerst doe je
voorbereidingen, je neemt de sample en fragmenteert het DNA. Hieraan hang j
adapters waardoor je de sequencing library verkrijgt dat je gebruikt voor
sequencing. Illumina gebruikt een flowcell waarin probes zitten, een stukje sequentie die
kunnen binden aan de adapters. Als je je library toevoegt aan de flow cell bindt deze dus
aan de probes. Vervolgens maak je kopieën van strengen die gebonden zijn, cluster
amplification.
- Een DNA streng dat gebonden is aan adapter buigt en bindt aan een andere probe
gezien beide kanten een adapter hebben. Het nieuw gebonden deel van de adapter
zal een primer binden en wordt het DNA gekopieerd. Nu heb je twee strengen die
gebonden zijn en reverse van elkaar zijn. Dia 58
Vervolgens ga je sequencen met behulp van een lichtsignaal dat gegenereerd wordt door
een fluorescent label. Elke nucleotide heeft een eigen label, zoals elke A groen. Bij elke
DNA streng vind elongatie plaats waarbij steeds een foto wordt genomen van de
lichtsignalen en het fluorescente label en de terminator wordt verwijderd waardoor weer
verder geelongeerd kan worden. Hierdoor lees je de foto's achter elkaar uit als de sequentie
zoals hieronder.
,Je weet nu alleen niet waar dit stuk sequentie vandaan komt, je hebt een sequentie, maar
van welk deel op het DNA is dit afkomstig. Dit komt door fragmentatie en de willekeurige
verdeling over de flow cell van het DNA. Je moet dus nog de alignment and data analysis
doen. Je hebt een bestand met vele korte sequenties. De eerste stap is alignement, je
vergelijkt je reads met een referentie sequentie en kijkt waar je reads het beste passen. De
hoeveelheid reads die overeenkomen met een enkele nucleotide in vergelijking met
referentie genoom is de coverage, zie dia 72 voor een coverage van 4. Als je sequenced
vanaf 1 kant heb je single-end sequencen, je kan dus ook paired-end sequencen. Paired
is makkelijker voor alignment.
Om kosten te besparen kan je verschillende samples
combineren in een flowcell. Aan je insert wordt links en
rechts een adapter geplaatst. P5 en P7 zijn
complementair met de adapters. SP1 en SP2 zijn
binding plaatsen voor sequencing primers. i5 en i7
index zijn korte sequenties die behoren tot een
specifieke library. Je kan daarmee samples mixen, maar
door i5 en i7 kan je ze terug relateren aan herkomst van
je sample.
Belangrijke verschillen NGS vs Sanger is dat de kosten van Sanger sequencing veel
hoger ligt, een voordeel van sanger is dat het accurater is dan NGS en de read lengt van
NGS is korter dan sanger (35-250 bp vs 650-800 bp).
Sequencing fouten worden uitgedrukt in een percentage van de base die incorrect worden
bepaald. Een fout is niet te herkennen van een variant zoals een SNP, dit kan worden
voorkomen door meerdere reads te nemen, want de kans dat dezelfde fout op dezelfde
plaats is klein.
02 - 04 / exome sequencing
Bij exome sequencing wil je een bepaalde DNA mutatie achterhalen die causaal is voor
een ziekte. Hierbij wordt dus gekeken naar exonen en naar de veranderingen die optreden
in het eiwit dat gecodeerd wordt door een exon. Ongeveer 1,5% van je DNA is exon.
Voornaamste toepassing is dus bij mendelian diseases, genetische single gene disorders
die mendelian patronen volgen van overerving. De kosten voor een humaan exome
sequentie is 10 dollar, bij 0,01 dollar per 1000 Mb, dit is dus een stuk goedkoper.
Zoveel mogelijk patiënten met dezelfde zeldzame ziekte verzamelen om hiervan hun DNA te
verkrijgen, waaruit je alleen de exonen haalt ofwel exon capturing. Vervolgens sequence je
en vergelijk je dit met referentie sequenties, hieruit wil je uiteindelijk diagnose en wellicht een
behandeling opstellen.
- Exon capturing kan middels probes die synthetisch gemaakt zijn die overeen komen
met de exonen. Je spoelt alles weg wat niet gebonden is, ofwel geen probe heeft
voor het exon. Microarray is een voorbeeld hiervan.
Je krijgt dus vele reads die overlappen met exonen. Het referentie genoom komt uit een
npublieke database en ga je alignen en zoeken naar verschillen ofwel mutaties die
, kandidaat (kunnen) zijn voor het veroorzaken van de ziekte. Stel je vindt een SNP tussen je
referentiegenoom en een read wil je weten of dit een mutatie of sequentie fout is.
- Je vergelijkt tussen patiënten waar mutaties
voorkomen, wellicht vind je tussen alle
patiënten een mutatie die steeds aanwezig is.
Resultaat: Lijst met varianten die de patiënten
gemeenschappelijk hebben. Hier wordt
gekeken naar genen en niet naar
specifieke posities in genen.
- Je kan verschillen in patiënten vergelijken tot
de referentie.
- Je verwijdert alle SNPs die veelvoorkomend
zijn.
Kennis over de achtergrond of overerving van de ziekte kan ook helpen met het
doorgronden van de ziekte, zo kan je meerdere filters toepassen.
- Bij een De Novo mutatie kan je niet alleen de patiënt sequencen, maar ook de
ouders gezien bij de ouders deze niet voor zou moeten komen.
- Bij een overervende ziekte kan je de ouders ook mee nemen in sequencen, gezien
hier de mutatie ook voor zou moeten komen.
NGS ofwel, next generation sequencing, valt onder genomics. Het aantal nucleotiden van
het humane genoom is 3,000,000,000. Er zijn 20,000 humane genen die gemiddeld 10-15
kb groot zijn, maar hierin zit grote variatie. Per zoogdiercel zit er 10pg DNA.
Met DNA sequencing verkrijg je de sequentie van nucleotiden van een organisme haar
genoom. Eerst neem je een sample hiervan DNA extraheren, library of DNA fragments
ofwel voorbereiden en vervolgens sequencen. Sequencen ging vroeger middels radioactief
labelen van nucleotiden, elektroforese en vervolgens handmatig interpreteren dit werd
geautomatiseerd. Illumina is nu de grootste in sequencing apparaten, zij maken het
mogelijk gehele genomen van individuen of populaties te meten. Er zijn vele toepassingen
voor sequencing zoals variant detection, splice variant detection, RNA-seq
etc.
Bij sanger sequencing sequence je 1 molecuul DNA tegelijk, je voegt voor
PCR nucleotiden toe die de elongatie stoppen waardoor de polymerase reactie
stopt. Dit gebeurt per nucleotide, dus in 4 buisjes. Vervolgens laat je dit runnen
over een gel en kan je van onder naar boven lezen wat de sequentie is.
High-throughput sequencing zoals NGS en MPS. Eerst doe je
voorbereidingen, je neemt de sample en fragmenteert het DNA. Hieraan hang j
adapters waardoor je de sequencing library verkrijgt dat je gebruikt voor
sequencing. Illumina gebruikt een flowcell waarin probes zitten, een stukje sequentie die
kunnen binden aan de adapters. Als je je library toevoegt aan de flow cell bindt deze dus
aan de probes. Vervolgens maak je kopieën van strengen die gebonden zijn, cluster
amplification.
- Een DNA streng dat gebonden is aan adapter buigt en bindt aan een andere probe
gezien beide kanten een adapter hebben. Het nieuw gebonden deel van de adapter
zal een primer binden en wordt het DNA gekopieerd. Nu heb je twee strengen die
gebonden zijn en reverse van elkaar zijn. Dia 58
Vervolgens ga je sequencen met behulp van een lichtsignaal dat gegenereerd wordt door
een fluorescent label. Elke nucleotide heeft een eigen label, zoals elke A groen. Bij elke
DNA streng vind elongatie plaats waarbij steeds een foto wordt genomen van de
lichtsignalen en het fluorescente label en de terminator wordt verwijderd waardoor weer
verder geelongeerd kan worden. Hierdoor lees je de foto's achter elkaar uit als de sequentie
zoals hieronder.
,Je weet nu alleen niet waar dit stuk sequentie vandaan komt, je hebt een sequentie, maar
van welk deel op het DNA is dit afkomstig. Dit komt door fragmentatie en de willekeurige
verdeling over de flow cell van het DNA. Je moet dus nog de alignment and data analysis
doen. Je hebt een bestand met vele korte sequenties. De eerste stap is alignement, je
vergelijkt je reads met een referentie sequentie en kijkt waar je reads het beste passen. De
hoeveelheid reads die overeenkomen met een enkele nucleotide in vergelijking met
referentie genoom is de coverage, zie dia 72 voor een coverage van 4. Als je sequenced
vanaf 1 kant heb je single-end sequencen, je kan dus ook paired-end sequencen. Paired
is makkelijker voor alignment.
Om kosten te besparen kan je verschillende samples
combineren in een flowcell. Aan je insert wordt links en
rechts een adapter geplaatst. P5 en P7 zijn
complementair met de adapters. SP1 en SP2 zijn
binding plaatsen voor sequencing primers. i5 en i7
index zijn korte sequenties die behoren tot een
specifieke library. Je kan daarmee samples mixen, maar
door i5 en i7 kan je ze terug relateren aan herkomst van
je sample.
Belangrijke verschillen NGS vs Sanger is dat de kosten van Sanger sequencing veel
hoger ligt, een voordeel van sanger is dat het accurater is dan NGS en de read lengt van
NGS is korter dan sanger (35-250 bp vs 650-800 bp).
Sequencing fouten worden uitgedrukt in een percentage van de base die incorrect worden
bepaald. Een fout is niet te herkennen van een variant zoals een SNP, dit kan worden
voorkomen door meerdere reads te nemen, want de kans dat dezelfde fout op dezelfde
plaats is klein.
02 - 04 / exome sequencing
Bij exome sequencing wil je een bepaalde DNA mutatie achterhalen die causaal is voor
een ziekte. Hierbij wordt dus gekeken naar exonen en naar de veranderingen die optreden
in het eiwit dat gecodeerd wordt door een exon. Ongeveer 1,5% van je DNA is exon.
Voornaamste toepassing is dus bij mendelian diseases, genetische single gene disorders
die mendelian patronen volgen van overerving. De kosten voor een humaan exome
sequentie is 10 dollar, bij 0,01 dollar per 1000 Mb, dit is dus een stuk goedkoper.
Zoveel mogelijk patiënten met dezelfde zeldzame ziekte verzamelen om hiervan hun DNA te
verkrijgen, waaruit je alleen de exonen haalt ofwel exon capturing. Vervolgens sequence je
en vergelijk je dit met referentie sequenties, hieruit wil je uiteindelijk diagnose en wellicht een
behandeling opstellen.
- Exon capturing kan middels probes die synthetisch gemaakt zijn die overeen komen
met de exonen. Je spoelt alles weg wat niet gebonden is, ofwel geen probe heeft
voor het exon. Microarray is een voorbeeld hiervan.
Je krijgt dus vele reads die overlappen met exonen. Het referentie genoom komt uit een
npublieke database en ga je alignen en zoeken naar verschillen ofwel mutaties die
, kandidaat (kunnen) zijn voor het veroorzaken van de ziekte. Stel je vindt een SNP tussen je
referentiegenoom en een read wil je weten of dit een mutatie of sequentie fout is.
- Je vergelijkt tussen patiënten waar mutaties
voorkomen, wellicht vind je tussen alle
patiënten een mutatie die steeds aanwezig is.
Resultaat: Lijst met varianten die de patiënten
gemeenschappelijk hebben. Hier wordt
gekeken naar genen en niet naar
specifieke posities in genen.
- Je kan verschillen in patiënten vergelijken tot
de referentie.
- Je verwijdert alle SNPs die veelvoorkomend
zijn.
Kennis over de achtergrond of overerving van de ziekte kan ook helpen met het
doorgronden van de ziekte, zo kan je meerdere filters toepassen.
- Bij een De Novo mutatie kan je niet alleen de patiënt sequencen, maar ook de
ouders gezien bij de ouders deze niet voor zou moeten komen.
- Bij een overervende ziekte kan je de ouders ook mee nemen in sequencen, gezien
hier de mutatie ook voor zou moeten komen.
