Samenvatting moleculaire microbiologie
Les 1 en 2
Klassieke technieken:
- Morfologie
- Bacterie kleuringen
- Groei op kweekmedia onder verschillende laboratorium condities
- Fenotypering op basis van biologische kenmerken (identificatie: bonte rij, Api)
- Nadeel van klassieke technieken is dat het veel tijd kost. Bacteriën moeten groeien
etc.
Moderne technieken:
- Rt PCR: amplificatie (qPCR is kwanitifactie)
- Sequencing
- Maldi-TOF
- Microscopie
- Andere testen zoals: hybridisatie (array), serologische testen (ELISA, agglutinatie
testen etc.)
Moleculaire technieken – mijlpalen:
- James Watson en Francis Crick (1953): Ontrafeling dubbele helix structuur (Nobelprijs
1962)
- Fred Sanger (1975): Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek (Nobelprijs 1980)
- Kary Mullis (1983): Uitvinding Polymerase Chain Reaction (Nobelprijs 1994)
- Roche 1992: Eerste commerciële moleculaire tests
Je begint bij het samplen van virus/bacterie, zodat je DNA krijgt. Bij bacterieonderzoek wordt
gebruik gemaakt van 16s RNA. Het is een onderdeel van ribosoom. Je kan het goed
gebruiken voor identificatie van soorten.
PCR en Q-PCR:
o Gebruikt als identificatiemethode op een moleculair lab
- Soort-specifieke amplificatie van 16s rRNA gen
- Amplificatie van soort-specifieke genen (virulentie factoren)
- Amplificatie van familie-specifieke DNA fragmenten (‘’huishoudgenen’’)
- Amplificatie van resistentie-genen
- Amplificatie van het hele genoom
,DNA nucleotiden:
- Fosfaatgroep
- Suikergroep (deoxyribose)
- Stikstofbase (A,G,C, T)
- Purines: Adenine en Guanine
- Pyrimidines: Thymine en Cytosine
- 3 nucleotiden: een triplet of codon (coderen voor een specifiek aminozuur)
- Aminozuren zijn de bouwstenen van eiwitten
Chemische structuur DNA:
- Lange, dubbele helix met suiker (deoxyribose) en fosfaat buitenstructuur. Basen aan
de binnenzijde.
- Gestabiliseerd door waterstofbruggen tussen de basen.
- Strengen in tegenovergestelde richting en anti-parallel (reverse complement).
DNA:
- Een purine (A en G) bindt altijd met een pyrimidine (C en T) base (behoudt de
structuur).
- Adenine bindt aan thymine met twee waterstofbruggen.
- Guanine bindt aan cytosine met drie waterstofbruggen.
2
,Verschil DNA en RNA:
- DNA heeft deoxyribose, RNA heeft ribose
- DNA heeft 2 strengen, RNA heeft 1 streng
- DNA heeft thymine, RNA heeft uracil
Reverse transcriptase:
- Er ontstaat een DNA-RNA hybride
- Reverse transcriptase: an enzyme binds to oligo (nucleotidensequentie met een
beperkt aantal nucleotiden) dT primer and synthesis the cDNA (DNA dat door
reverse-transcriptase uit mRNA is verkregen; bevat geen introns of
signaalsequenties) by adding dNTPs.
- RNA hybrid formation: first – strand cDNA synthesis
Essentiële ingrediënten PCR-mix:
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle 4 de dNTPs
o 20-200 micrometer van alle 4 de dNTPs
o Een te hoge concentratie kan synthesefouten veroorzaken
- PCR-buffer
o Tris-HCL buffer van pH=7,8 is optimaal
o Optioneel zijn Tween (stabilisteert Taq), BSA en eenwaardige ionen
- Taq-DNA polymerase (Thermus aquaticus)
o Essentieël: hittestabiel
o Snelle synthese
o Gevoelig voor allerlei remmende stoffen
o Géén 3’-5’ exonuclease activiteit, dus géén proofreading
- MgCl2, essentiële co-factor voor Taq en heeft stabiliserend effect
3
, - Primers
o Ongeveer tussen de 18-25 nucleotiden lang
o Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC gehalte (40% tot 70%)
o Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
o Géén baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen twee primrs (primer-
dimeer)
o Amplicon (piece of DNA or RNA that is the source and/or product of
amplification or replication events) bij voorkeur 75-200 basenparen.
Hoogste efficiëntie
o Smelttemperatuur (Tm ) tussen circa 50 en 65 graden celcius
- Polymerase remmers
o Proteolytische enzymen (pronase, proteïnase K)
o Heparine, ijzerionen profyrine-skeletten (bloed)
o DMSO (hoge concentratie)
o Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties
o SDS
o Ureum
Keuze gen:
Conservatief houdt in dat de sequenties erg op elkaar lijken.
Goede primers:
- voordeel rtPCR: geen
gel nodig.
- Voor PCR detectie
van specifieke
sequenties (lab
vereisten):
1. Specifieke
technische
handelingen,
reagentia en
personeel.
4
Les 1 en 2
Klassieke technieken:
- Morfologie
- Bacterie kleuringen
- Groei op kweekmedia onder verschillende laboratorium condities
- Fenotypering op basis van biologische kenmerken (identificatie: bonte rij, Api)
- Nadeel van klassieke technieken is dat het veel tijd kost. Bacteriën moeten groeien
etc.
Moderne technieken:
- Rt PCR: amplificatie (qPCR is kwanitifactie)
- Sequencing
- Maldi-TOF
- Microscopie
- Andere testen zoals: hybridisatie (array), serologische testen (ELISA, agglutinatie
testen etc.)
Moleculaire technieken – mijlpalen:
- James Watson en Francis Crick (1953): Ontrafeling dubbele helix structuur (Nobelprijs
1962)
- Fred Sanger (1975): Ontwikkeling efficiënte sequence methodiek (Nobelprijs 1980)
- Kary Mullis (1983): Uitvinding Polymerase Chain Reaction (Nobelprijs 1994)
- Roche 1992: Eerste commerciële moleculaire tests
Je begint bij het samplen van virus/bacterie, zodat je DNA krijgt. Bij bacterieonderzoek wordt
gebruik gemaakt van 16s RNA. Het is een onderdeel van ribosoom. Je kan het goed
gebruiken voor identificatie van soorten.
PCR en Q-PCR:
o Gebruikt als identificatiemethode op een moleculair lab
- Soort-specifieke amplificatie van 16s rRNA gen
- Amplificatie van soort-specifieke genen (virulentie factoren)
- Amplificatie van familie-specifieke DNA fragmenten (‘’huishoudgenen’’)
- Amplificatie van resistentie-genen
- Amplificatie van het hele genoom
,DNA nucleotiden:
- Fosfaatgroep
- Suikergroep (deoxyribose)
- Stikstofbase (A,G,C, T)
- Purines: Adenine en Guanine
- Pyrimidines: Thymine en Cytosine
- 3 nucleotiden: een triplet of codon (coderen voor een specifiek aminozuur)
- Aminozuren zijn de bouwstenen van eiwitten
Chemische structuur DNA:
- Lange, dubbele helix met suiker (deoxyribose) en fosfaat buitenstructuur. Basen aan
de binnenzijde.
- Gestabiliseerd door waterstofbruggen tussen de basen.
- Strengen in tegenovergestelde richting en anti-parallel (reverse complement).
DNA:
- Een purine (A en G) bindt altijd met een pyrimidine (C en T) base (behoudt de
structuur).
- Adenine bindt aan thymine met twee waterstofbruggen.
- Guanine bindt aan cytosine met drie waterstofbruggen.
2
,Verschil DNA en RNA:
- DNA heeft deoxyribose, RNA heeft ribose
- DNA heeft 2 strengen, RNA heeft 1 streng
- DNA heeft thymine, RNA heeft uracil
Reverse transcriptase:
- Er ontstaat een DNA-RNA hybride
- Reverse transcriptase: an enzyme binds to oligo (nucleotidensequentie met een
beperkt aantal nucleotiden) dT primer and synthesis the cDNA (DNA dat door
reverse-transcriptase uit mRNA is verkregen; bevat geen introns of
signaalsequenties) by adding dNTPs.
- RNA hybrid formation: first – strand cDNA synthesis
Essentiële ingrediënten PCR-mix:
- Target DNA (gezuiverd)
- Alle 4 de dNTPs
o 20-200 micrometer van alle 4 de dNTPs
o Een te hoge concentratie kan synthesefouten veroorzaken
- PCR-buffer
o Tris-HCL buffer van pH=7,8 is optimaal
o Optioneel zijn Tween (stabilisteert Taq), BSA en eenwaardige ionen
- Taq-DNA polymerase (Thermus aquaticus)
o Essentieël: hittestabiel
o Snelle synthese
o Gevoelig voor allerlei remmende stoffen
o Géén 3’-5’ exonuclease activiteit, dus géén proofreading
- MgCl2, essentiële co-factor voor Taq en heeft stabiliserend effect
3
, - Primers
o Ongeveer tussen de 18-25 nucleotiden lang
o Primerpaar: vergelijkbaar hoog GC gehalte (40% tot 70%)
o Primerpaar: ongeveer dezelfde annealing temperatuur
o Géén baseparing mogelijk in de primer zelf of tussen twee primrs (primer-
dimeer)
o Amplicon (piece of DNA or RNA that is the source and/or product of
amplification or replication events) bij voorkeur 75-200 basenparen.
Hoogste efficiëntie
o Smelttemperatuur (Tm ) tussen circa 50 en 65 graden celcius
- Polymerase remmers
o Proteolytische enzymen (pronase, proteïnase K)
o Heparine, ijzerionen profyrine-skeletten (bloed)
o DMSO (hoge concentratie)
o Urinecomponenten en hoge zoutconcentraties
o SDS
o Ureum
Keuze gen:
Conservatief houdt in dat de sequenties erg op elkaar lijken.
Goede primers:
- voordeel rtPCR: geen
gel nodig.
- Voor PCR detectie
van specifieke
sequenties (lab
vereisten):
1. Specifieke
technische
handelingen,
reagentia en
personeel.
4
