Methoden H2: DNA-analyse
3.2.1. DNA-sequentiebepaling
Evolutie in de methoden voor sequentiebepaling
1. First generation sequencing (1977)
= de gouden standaard voor kleine projecten die moeten weten of een bepaalde
sequentie in een staal aanwezig is
- Sanger sequencing
- Kloneren van bepaalde DNA-sequenties
- Elektroforese voor het scheiden van fragmenten op grootte
2. Second generation sequencing (2006)
= next generation sequencing (NGS) dat kijkt naar korte fragmenten in ons genoom (35-
100 baseparen) en aan de hand daarvan puzzel je het genoom in elkaar
- Sequencen van clonaal in vitro geamplificeerde DNA moleculen
- Bijvoorbeeld: Ilumina, Ion Torrent, …
3. Third generation sequencing (2010)
= je kan hiermee naar lange stukken DNA kijken (tot een miljoen basen per reactie)
- Sequencing van individuele DNA-moleculen (dus geen nood aan pre-
amplificatie!!)
- Bijvoorbeeld: Nanopore, Pacific Biosiences
Verandering in sequencing-technologie = verandering in capaciteit en snelheid
• First generation: volledige humane genoom sequencen voor € 3 miljard op 10
jaar tijd
• Second generation: 1 toestel kan het volledige humane genomen sequencen
voor een fractie van de prijs
• Third generation: voor minder dan $1000 een humaan genoom sequencen
,Brede toepassingen van sequencen
1. De novo genoom sequentiebepaling
= sequentie bepalen van genomen die je voordien nog niet kende (gedeeltelijk/volledig)
Bijvoorbeeld: Human Genome Project, het genoom van SARS-virussen voor de eerste
keer sequencen, …
2. Resequencing
= de sequentie van een individu bepalen door het te vergelijken met een
referentiegenoom (zoals dat van de mens)
Bijvoorbeeld: de technologie die gebruikt wordt om mutaties, ziektes, SNP’s, … op te
sporen + construct verificatie + andere klinische toepassingen (zoals diagnostiek)
3. Sequentiebepaling als teller
= aantal DNA/RNA moleculen tellen om te kijken hoeveel moleculen er in een bepaald
staal zitten
Bijvoorbeeld: RNAseq, ChIPseq, …
Verschillende vormen/toepassingen van sequencing
a) Whole Genome Sequencing (WGS)
= bijvoorbeeld voor het Human Genome Project
b) Whole Exome Sequencing (WES)
= wanneer je enkel de coderende sequenties wilt bekijken
= 1,5% van het genoom moet worden gesequenced (daarom ook goedkoper)
c) Targeted sequencing
= specifieke/gewenste regio’s bekijken
Bijvoorbeeld: wanneer je weet dat een mutatie specifiek op het X-chromosoom
ligt, sequencieer je regio’s op het X-chromosoom om deze te zoeken
3.2.1.1 FIRST GENERATION SEQUENCING
2 soorten “First Generation Sequencing”
1. Maxam en Gilbert
2. Sanger
, à Reactimengsel maken waarin een bepaald DNA-fragment aanwezig is (in
meerdere kopijen)
= nakijken welke sequentie hier aanwezig is
amplicon + primer (=
oligonucleotide) + dNTPs +
DNApolymerase + ddATP
ddATP = dideoxynucleotide =
zuurstof op 3’ C is weg
De zuurstof die wel nog aanwezig WAS, is essentieel voor het verlengen van de keten (=
de basen aan elkaar hangen).
= zonder zuurstof kan er geen extensie meer gebeuren en stopt de reactie dus!!
DNApolymerase begint met het inbouwen van de basen, en kan op sommige momenten
een ddATP inbouwen (of een normale dATP) à wanneer de “dd” gekozen wordt, stopt de
elongatie van het fragment.
ð In één reactiemengsel krijg je verschillende fragmenten van een verschillende
grootte = DNA sorteren op grootte.
, DNA-fragmenten werden origineel radioactief gelabeld => nu worden ze fluorescent
gelabeld en uiteindelijk op grootte gesorteerd via gel-elektroforese (signaal wordt
gemeten door een detector op het einde van de reactie)
= DNA-sequentie bepalen
Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten verlenging
• Template/matrijs = clone of PCR amplicon
• Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met
verschillende fluorescente label)
• Reactie loopt door na inbouwen dNTP
• Reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP
• Scheiding strengen op gel of capillair à elektroferogram
Nadelen: beperkt tot ~500 nt + moeite met herhalingen
Voor betrouwbaarheid: best twee aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen
af te lezen
Hoe kan je zo’n elektroferogram aflezen?
- Veschillende intensiteiten van elk van de basen aflezen
- Eerste paar basen zijn moeilijker af te lezen
- Per base krijg je een score: hoe zeker ben je dat dit echt de base is?
= Phred score = Q
Bijvoorbeeld: Phred score van 10
à In 1 op de 10 gevallen heeft het programma een verkeerde base gelezen
à Ideaal is de score > 30
Aan de hand van sequencing trace kan je mutaties detecteren!!
3.2.1. DNA-sequentiebepaling
Evolutie in de methoden voor sequentiebepaling
1. First generation sequencing (1977)
= de gouden standaard voor kleine projecten die moeten weten of een bepaalde
sequentie in een staal aanwezig is
- Sanger sequencing
- Kloneren van bepaalde DNA-sequenties
- Elektroforese voor het scheiden van fragmenten op grootte
2. Second generation sequencing (2006)
= next generation sequencing (NGS) dat kijkt naar korte fragmenten in ons genoom (35-
100 baseparen) en aan de hand daarvan puzzel je het genoom in elkaar
- Sequencen van clonaal in vitro geamplificeerde DNA moleculen
- Bijvoorbeeld: Ilumina, Ion Torrent, …
3. Third generation sequencing (2010)
= je kan hiermee naar lange stukken DNA kijken (tot een miljoen basen per reactie)
- Sequencing van individuele DNA-moleculen (dus geen nood aan pre-
amplificatie!!)
- Bijvoorbeeld: Nanopore, Pacific Biosiences
Verandering in sequencing-technologie = verandering in capaciteit en snelheid
• First generation: volledige humane genoom sequencen voor € 3 miljard op 10
jaar tijd
• Second generation: 1 toestel kan het volledige humane genomen sequencen
voor een fractie van de prijs
• Third generation: voor minder dan $1000 een humaan genoom sequencen
,Brede toepassingen van sequencen
1. De novo genoom sequentiebepaling
= sequentie bepalen van genomen die je voordien nog niet kende (gedeeltelijk/volledig)
Bijvoorbeeld: Human Genome Project, het genoom van SARS-virussen voor de eerste
keer sequencen, …
2. Resequencing
= de sequentie van een individu bepalen door het te vergelijken met een
referentiegenoom (zoals dat van de mens)
Bijvoorbeeld: de technologie die gebruikt wordt om mutaties, ziektes, SNP’s, … op te
sporen + construct verificatie + andere klinische toepassingen (zoals diagnostiek)
3. Sequentiebepaling als teller
= aantal DNA/RNA moleculen tellen om te kijken hoeveel moleculen er in een bepaald
staal zitten
Bijvoorbeeld: RNAseq, ChIPseq, …
Verschillende vormen/toepassingen van sequencing
a) Whole Genome Sequencing (WGS)
= bijvoorbeeld voor het Human Genome Project
b) Whole Exome Sequencing (WES)
= wanneer je enkel de coderende sequenties wilt bekijken
= 1,5% van het genoom moet worden gesequenced (daarom ook goedkoper)
c) Targeted sequencing
= specifieke/gewenste regio’s bekijken
Bijvoorbeeld: wanneer je weet dat een mutatie specifiek op het X-chromosoom
ligt, sequencieer je regio’s op het X-chromosoom om deze te zoeken
3.2.1.1 FIRST GENERATION SEQUENCING
2 soorten “First Generation Sequencing”
1. Maxam en Gilbert
2. Sanger
, à Reactimengsel maken waarin een bepaald DNA-fragment aanwezig is (in
meerdere kopijen)
= nakijken welke sequentie hier aanwezig is
amplicon + primer (=
oligonucleotide) + dNTPs +
DNApolymerase + ddATP
ddATP = dideoxynucleotide =
zuurstof op 3’ C is weg
De zuurstof die wel nog aanwezig WAS, is essentieel voor het verlengen van de keten (=
de basen aan elkaar hangen).
= zonder zuurstof kan er geen extensie meer gebeuren en stopt de reactie dus!!
DNApolymerase begint met het inbouwen van de basen, en kan op sommige momenten
een ddATP inbouwen (of een normale dATP) à wanneer de “dd” gekozen wordt, stopt de
elongatie van het fragment.
ð In één reactiemengsel krijg je verschillende fragmenten van een verschillende
grootte = DNA sorteren op grootte.
, DNA-fragmenten werden origineel radioactief gelabeld => nu worden ze fluorescent
gelabeld en uiteindelijk op grootte gesorteerd via gel-elektroforese (signaal wordt
gemeten door een detector op het einde van de reactie)
= DNA-sequentie bepalen
Sanger sequencing = nieuwsynthese met dideoxy-keten verlenging
• Template/matrijs = clone of PCR amplicon
• Polymerase + primer + mengsel van 4 dNTPs + ddNTPs (elke ddNTP met
verschillende fluorescente label)
• Reactie loopt door na inbouwen dNTP
• Reactie (keten) stopt na inbouwen ddNTP
• Scheiding strengen op gel of capillair à elektroferogram
Nadelen: beperkt tot ~500 nt + moeite met herhalingen
Voor betrouwbaarheid: best twee aparte reacties (FW of RV primer) om beide richtingen
af te lezen
Hoe kan je zo’n elektroferogram aflezen?
- Veschillende intensiteiten van elk van de basen aflezen
- Eerste paar basen zijn moeilijker af te lezen
- Per base krijg je een score: hoe zeker ben je dat dit echt de base is?
= Phred score = Q
Bijvoorbeeld: Phred score van 10
à In 1 op de 10 gevallen heeft het programma een verkeerde base gelezen
à Ideaal is de score > 30
Aan de hand van sequencing trace kan je mutaties detecteren!!
