Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
o Nanopore sequencing based on changes in current
à Door eiwitporie gemaakt in membraan ga je eiwitten trekken =>
veranderingen in stroom afhankelijk v welk AZ er passeert (want alle AZ hebben
een verschillende vorm) => veranderingen in stroom meten => AZ-sequentie
lezen
à Nadeel: verschillen tussen AZ zijn niet geweldig groot => nog niet optimaal
o Nanopore sequencing based on translocation of protein immobilized to atomic
force microscope tip
à Eiwit dat we willen sequencen koppelen aan tip van atomic force microscope
=> eiwit trekken door porie doorheen membraan => afhankelijk v welke AZ daar
in zitten, ga je daar harder/minder hard aan moeten trekken => dat kun je
registreren => AZ-sequentie afleiden
à Grotere poriën => intacte eiwitten (natieve eiwitten) erdoor trekken => zegt
iets over de opvouwing vh eiwit (3D-structuur)
129
,Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Single cell proteomics
Verschillende methoden:
- Single Cell Westerns
- Fluorescence Flow Cytometry
- Mass cytometry (CyTOF)
- ELISpot / siMOA / MACS Chip
- Proximity Extension Assay
Single Cell Westerns
- 1 cel per putje in PAA-gel
- Lyseren
à Eiwitten komen vrij, maar blijven wel in putje
- Elektroforese
à Eiwitten gaan migreren volgens massa/grootte/lading (zoals je zelf wilt)
- Eiwitten crosslinken aan gel met UV
à Overblotten op membraan is hierbij niet nodig
- Incuberen met AS (1st en
fluor-2nd)
- Fluorescentie meten
- Meerdere stripping rondes
- Beperkte gevoeligheid
à Meest abundante eiwitten
zul je wel kunnen zien, maar
eiwitten die weinig voorkomen
zijn moeilijker te detecteren
- Beperkte multiplexing
130
,Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Fluorescence Flow Cytometry
- Cellen al dan niet permeabiliseren
à Afhankelijk of je gaat kijken naar eiwitten die aan oppervlak v cel zitten of
binnenin
- Incuberen met fluorescent gemerkte AS (multiplex)
à Je kunt verschillende kleurtjes gebruiken
à Via cell sorting flow cytometry cellen van elkaar scheiden volgens kleurtje op AS
=> tellen => in grafiek brengen => kijken naar welke eiwitten tot expressie komen in
welke cel (single cell analyse dus)
- Één voor één fluorescentie meten in flow
- Beperkte multiplexing
à Beperkt door het aantal merkers dat je kan gebruiken
- Variant: Imaging flow cytometry (met fluorescence microscopy van elke cel)
à Toestel waar microscoop zit ingebouwd => prentje gemaakt v elke cel => kijken
waar fluorescente merkers zitten
131
, Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Mass cytometry (CyTOF)
- Cellen al dan niet permeabiliseren
à Afhankelijk of je naar eiwitten wilt gaan kijken op het oppervlak of ergens in de cel
- Incuberen met AS gemerkt met stabiele transitie-metaal element isotopen
à Er zijn een 50-tal verschillende transitiemetalen => naar 50-tal verschillende
eiwitten tegelijk gaan kijken
- Cellen via nebulizer één voor één scheiden
à Cel in druppeltje
- Cellen één voor één in verbrandingskamer (ICP) verbranden tot atomair niveau
- Metaalatomen scheiden van C, O, N, H via quadrupool
à Enkel transitiemetalen gaan door
- Metalen scheiden via TOF en kwantificeren, cel per cel
- Hoeveelheid specifiek metaalelement = maat voor aanwezigheid van specifiek eiwit
à Spectrum met allemaal intensiteiten v al die verschillende transitiemetalen, cel
per cel
à Intensiteit = hoeveel vd AS v dat transitiemetaal (en later ook hoeveel eiwitten)
aanwezig waren in single cell
- Beperkt aantal merkers (50-tal)
132
o Nanopore sequencing based on changes in current
à Door eiwitporie gemaakt in membraan ga je eiwitten trekken =>
veranderingen in stroom afhankelijk v welk AZ er passeert (want alle AZ hebben
een verschillende vorm) => veranderingen in stroom meten => AZ-sequentie
lezen
à Nadeel: verschillen tussen AZ zijn niet geweldig groot => nog niet optimaal
o Nanopore sequencing based on translocation of protein immobilized to atomic
force microscope tip
à Eiwit dat we willen sequencen koppelen aan tip van atomic force microscope
=> eiwit trekken door porie doorheen membraan => afhankelijk v welke AZ daar
in zitten, ga je daar harder/minder hard aan moeten trekken => dat kun je
registreren => AZ-sequentie afleiden
à Grotere poriën => intacte eiwitten (natieve eiwitten) erdoor trekken => zegt
iets over de opvouwing vh eiwit (3D-structuur)
129
,Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Single cell proteomics
Verschillende methoden:
- Single Cell Westerns
- Fluorescence Flow Cytometry
- Mass cytometry (CyTOF)
- ELISpot / siMOA / MACS Chip
- Proximity Extension Assay
Single Cell Westerns
- 1 cel per putje in PAA-gel
- Lyseren
à Eiwitten komen vrij, maar blijven wel in putje
- Elektroforese
à Eiwitten gaan migreren volgens massa/grootte/lading (zoals je zelf wilt)
- Eiwitten crosslinken aan gel met UV
à Overblotten op membraan is hierbij niet nodig
- Incuberen met AS (1st en
fluor-2nd)
- Fluorescentie meten
- Meerdere stripping rondes
- Beperkte gevoeligheid
à Meest abundante eiwitten
zul je wel kunnen zien, maar
eiwitten die weinig voorkomen
zijn moeilijker te detecteren
- Beperkte multiplexing
130
,Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Fluorescence Flow Cytometry
- Cellen al dan niet permeabiliseren
à Afhankelijk of je gaat kijken naar eiwitten die aan oppervlak v cel zitten of
binnenin
- Incuberen met fluorescent gemerkte AS (multiplex)
à Je kunt verschillende kleurtjes gebruiken
à Via cell sorting flow cytometry cellen van elkaar scheiden volgens kleurtje op AS
=> tellen => in grafiek brengen => kijken naar welke eiwitten tot expressie komen in
welke cel (single cell analyse dus)
- Één voor één fluorescentie meten in flow
- Beperkte multiplexing
à Beperkt door het aantal merkers dat je kan gebruiken
- Variant: Imaging flow cytometry (met fluorescence microscopy van elke cel)
à Toestel waar microscoop zit ingebouwd => prentje gemaakt v elke cel => kijken
waar fluorescente merkers zitten
131
, Methoden in het biomedisch onderzoek 3 2024-2025
Mass cytometry (CyTOF)
- Cellen al dan niet permeabiliseren
à Afhankelijk of je naar eiwitten wilt gaan kijken op het oppervlak of ergens in de cel
- Incuberen met AS gemerkt met stabiele transitie-metaal element isotopen
à Er zijn een 50-tal verschillende transitiemetalen => naar 50-tal verschillende
eiwitten tegelijk gaan kijken
- Cellen via nebulizer één voor één scheiden
à Cel in druppeltje
- Cellen één voor één in verbrandingskamer (ICP) verbranden tot atomair niveau
- Metaalatomen scheiden van C, O, N, H via quadrupool
à Enkel transitiemetalen gaan door
- Metalen scheiden via TOF en kwantificeren, cel per cel
- Hoeveelheid specifiek metaalelement = maat voor aanwezigheid van specifiek eiwit
à Spectrum met allemaal intensiteiten v al die verschillende transitiemetalen, cel
per cel
à Intensiteit = hoeveel vd AS v dat transitiemetaal (en later ook hoeveel eiwitten)
aanwezig waren in single cell
- Beperkt aantal merkers (50-tal)
132
