Samenvatting Blok 1101: Groei en Ontwikkeling I
Casus 1
1. Wat is de algemene structuur van de cel?
Organismen waarvan cellen een nucleus/celkern bevatten, worden eukaryoten genoemd.
Organismen waarvan cellen geen nucleus bevatten, worden prokaryoten genoemd. Onder de
prokaryoten vallen de bacteriën en de archaea (eencellige micro-organismen). De cellen van de mens
zijn eukaryotisch.
Organellen in de eukaryotische cel
Organellen zijn delen van een cel met bepaalde functies, die door membranen
worden begrensd (uitzondering = ribosomen).
- Nucleus → belangrijkste organel. Hierin ligt alle genetische informatie
van de cel opgeslagen. De nucleus bevat DNA-moleculen en wordt
omgeven door een dubbel membraan, de nucleaire envelop. Het
nucleoplasma is het vloeibare deel van de celkern.
- Nucleolus → (kernlichaam) ligt in de nucleus. Hierin wordt rRNA
gemaakt.
- Mitochondriën → regelen de energievoorziening van de cel. Dit doen
ze door voedselmoleculen te oxideren waarbij ATP ontstaat
(=oxidatieve fosforylering). ATP is de algemene brandstof van de cel.
Mitochondriën gebruiken zuurstof en geven CO2 af (=cellulaire
ademhaling). Mitochondriën bevatten twee aparte membranen,
waarvan de binnenste gevouwen is om het oppervlak zo groot
mogelijk te maken. Verder bevatten ze hun eigen DNA. Ze
reproduceren zich door zichzelf in tweeën te delen.
- Endoplasmatisch reticulum (ER) → onregelmatig doolhof van
onderling verbonden ruimten, ingesloten door een membraan.
Hier worden de meeste celmembraan-onderdelen en
exportproducten van de cel gemaakt. Er zijn twee soorten:
1. Het ruw ER (RER). Op het ruw ER liggen ribosomen, deze
zorgen voor het maken van eiwitten, door aminozuren aan
elkaar te koppelen.
2. Het glad ER (SER). Het glad ER zorgt voornamelijk voor
stofwisselingsprocessen in de cel. In sommige cellen maakt
het schadelijke stoffen onschadelijk en in andere cellen maakt
het bijvoorbeeld vetten.
- Golgi Apparaat → bestaat uit schoteltjes van membranen die op elkaar zijn gestapeld. Dit
bewerkt en verpakt ER-moleculen die naar een andere cel of naar een ander organel moeten
worden getransporteerd.
, - Lysosomen → kleine, onregelmatig gevormde organellen, die
verteringsenzymen bevatten. Er vindt intracellulaire vertering
plaats: ze geven de voedingsstoffen uit opgenomen
voedseldeeltjes vrij en breken de niet-gewenste moleculen af.
Deze niet-gewenste moleculen worden gerecycled of
uitgescheiden.
- Peroxisomen → kleine door een membraan ingesloten blaasjes.
Ze zorgen voor een veilige omgeving voor diverse reacties.
Waterstofperoxide wordt hierbij gebruikt om toxische moleculen
te inactiveren.
- Ribosomen → het meest voorkomende organel. Er zijn twee
types, een bevindt zich vrij in het cytoplasma en de ander zit vast
aan het ER. Ribosomen zijn de plek voor proteïne synthese.
Tussen het ER, het Golgi Apparaat en de lysosomen vindt voortdurend transport plaats. Dit transport
verloopt via transportblaasjes, door middel van endocytose (=opname van stoffen buiten de cel) en
exocytose (=afgifte van stoffen uit de cel). Endo- en exocytose worden ook gebruikt om materiaal de
cel in of uit te transporteren.
- Vesicles → opslag voor stoffen die van het glad ER en het Golgi Apparaat afkomen.
Cytoplasma en cytoskelet van de cel
Het cytoplasma is de vloeistof in een cel. Het is een geconcentreerde oplossing van grote en kleine
moleculen waar veel chemische reacties plaatsvinden. Hier wordt de eerste stap gemaakt in het
afbreken van voedselmoleculen en worden de meeste eiwitten gemaakt. De productie van eiwitten
wordt gedaan door de ribosomen van het RER.
Het cytoplasma is de verzamelterm voor het cytosol en alle celorganellen afgezien van het
celmembraan en de kern. Het cytosol is de vloeistof waarin de celorganellen liggen. Het bestaat
voornamelijk uit water, ionen, macromoleculen en metabolieten.
,Het cytoplasma is structureel opgebouwd door middel van het cytoskelet. Dit is een systeem van
eiwitdraden die vaak geankerd zitten aan het plasmamembraan en de nucleus. Er zijn drie soorten
eiwitdraden:
- Microfilamenten → (actinedraden) dit zijn de dunste draden en komen veel in spiercellen
voor. Het is het centrale deel in het mechanisme, het draagt de spanning van de cel en is
verantwoordelijk voor cel beweging en cel vorm.
- Microtubuli → dit zijn de dikste draden en lijken op holle buizen. Ze zijn nauw betrokken bij
de celdeling en zorgen voor transport van moleculen. Bepalen de algemene vorm van de cel
en de verspreiding van de celorganellen.
- Intermediaire draden → deze verstevigen de cel.
Aan deze drie draden zitten vaak nog andere eiwitten bevestigd. Samen vormen ze een systeem van
balken, touwen en motoren die de cel zijn mechanische kracht en vormgeeft en zorgt voor de
bewegingen van de cel. De binnenkant van een cel is constant in beweging. Motoreiwitten gebruiken
de energie van ATP om organellen en eiwitten door het cytoplasma te dragen en te verplaatsen door
de hele cel binnen enkele seconden (over de microtubuli heen).
Centrosoom en centriolen
Centriolen bestaan uit 9 triplets van microtubuli en zijn voornamelijk betrokken bij de celdeling. De
centriolen zijn aan een uiteinde geankerd aan een regio bij de nucleus genaamd het centrosoom. De
centrosoommatrix is het meest bekend voor het genereren van microtubuli en het organiseren van
de mitotische spindel bij de celdeling.
Centriolen vormen ook de basis van cilia en flagella:
- Cilia → zweepvormige, beweeglijke cel uitsteeksels die meestal in grote aantallen
voorkomen op blootgestelde oppervlakten van bepaalde cellen. Door de werking van deze
trilharen worden stoffen in één richting over cel oppervlakten bewogen.
- Flagella → uitsteeksels gevormd door centriolen. Ze zijn langer dan cilia. (alleen bij sperma
cel). Beweegt de cel zelf voort.
Celmembraan
Het celmembraan vormt de scheiding tussen het interne en externe milieu van de
cel. Het doel van het celmembraan is om ongewenste stoffen buiten de cel en
gewenste stoffen binnen de cel te houden. Het celmembraan is permeabel omdat
het voor bepaalde stoffen doorlaatbaar is. Het celmembraan bestaat uit een
dubbele laag fosfolipiden. Een fosfolipide is een amfipatisch molecuul: het bestaat
uit een apolair vetzuur (de staart) en een hydrofiele kop. In het celmembraan
zitten de apolaire staarten naar elkaar toe gericht en steken de polaire koppen
naar buiten. Dit komt doordat de polaire koppen zich aangetrokken voelen tot het
water waaruit cytoplasma grotendeels bestaat en de apolaire vetzuren zullen zich afstoten hiervan.
,In of op het celmembraan zitten ook een
heleboel eiwitten. De functie van deze eiwitten
is o.a het reguleren en faciliteren van het
transport van de stoffen. Daarnaast zorgen ze
voor de signaaloverdracht in de cel.
Naast fosfolipiden is cholesterol een belangrijke
bouwsteen van het celmembraan.
2. Wat is de gedetailleerde structuur van
DNA en RNA
Genoom → Het genoom beschrijft de combinatie van alle erfelijke factoren. Onder het genoom
wordt één complete set van chromosomen verstaan.
De chromosomen bestaan uit opgerold DNA. In niet-delende cellen is dit DNA niet zichtbaar en wordt
het chromatine genoemd. Vlak voordat een cel gaat delen, condenseert het DNA en worden het
chromosomen genoemd. 95% van het DNA is niet coderend junk-DNA.
Opbouw DNA
Elk DNA-molecuul is een polymeerketen dat wordt opgebouwd uit vier verschillende nucleotiden.
Een nucleotide is de combinatie van een fosfaatgroep, een desoxyribose (suikergroep) en een
stikstofbase (G,A,T,C).
De basen:
- Guanine (G) → purine
- Adenine (A) → purine
- Thymine (T) → pyrimidine
- Cytosine (C) → pyrimidine
Suikergroep:
DNA → desoxyribose (geen zuurstofatoom aan het tweede
koolstofatoom aanwezig, alleen een waterstofatoom)
Fosfaatgroep:
Vormt een fosfaat-esterverbinding met een nucleoside →
nucleotide
➔ Houdt het geheel bij elkaar en wordt daarom ook fosfaat
backbone genoemd.
A nucleoside = Base + Suiker
A nucleotide = Base + Suiker + Fosfaat
A nucleic acid = A chain of nucleotides
Ruimtelijke bouw
Het DNA heeft een dubbele helixstructuur. De twee zijkanten van
de ladder bestaan uit een suiker (desoxyribose) en de
fosfaatgroepen. Tussen de zijkanten lopen treden. Elke tree bestaat uit twee basen, waarvan beide
vastzitten aan een andere zijkant.
De basen en strengen zijn complementair aan elkaar. Er zijn twee vaste basenparen: G – C (3
waterstofbruggen) en A – T (2 waterstofbruggen). Het verschil in waterstofbruggen zorgt voor een
niet volledig symmetrische DNA-helix. De centrale as van de helix bevindt zich niet precies in het
,midden, waardoor een major groove en een minor groove ontstaat. De major groove is
toegankelijker voor eiwitten van buitenaf. De twee strengen hebben een tegenovergestelde
polariteit (richting). Dat houdt in dat het 5’-uiteinde altijd tegenover het 3’-uiteinde ligt.
4 soorten structuren:
1. Primaire structuur → hierbij wordt het DNA weergegeven met de fosfaatgroepen, de
suikergroepen en de volgorde van de basen.
2. Secundaire structuur → hierbij wordt het DNA
weergegeven in een dubbele helix, tot stand gekomen
door waterstofbruggen.
3. Tertiaire structuur → hierbij wordt de interactie tussen
delen van een polypeptide weergegeven. Er kunnen
tussen deze delen zwavelbruggen ontstaan.
4. Quaternaire structuur → hierbij wordt de interactie
tussen meerdere polypeptiden weergegeven.
DNA vormt nucleosomen doordat het DNA om histoneiwitkernen
(histonen) wordt gewonden. Deze nucleosomen vormen
vervolgens een spiraalvormige solenoïde. Deze solenoïden zijn
opgerold tot het uiteindelijke chromosoom.
Soorten DNA
Chromosomen → Chromosomen bestaan uit coderende genen
(exonen) en ‘nonsense-DNA’ of ‘junk-DNA’ (intronen). Nonsense-DNA is belangrijk voor de regulatie
van genen (genexpressie).
,Repeat sequenties → stukjes DNA die heel vaak herhaald
worden. Zulke repetitive repeats bestaan uit een gen dat
meerdere keren achter elkaar herhaald wordt, omdat er veel
van nodig is (bijvoorbeeld tRNA en rRNA).
- Middle repetitive → enkele repeats achter elkaar
- Highly repetitive → een hele rij van repeats achter
elkaar
Satelliet DNA → bevindt zich aan de uiteinden van
chromosomen en is te zien als een soort antennes. Het heeft
een hoog A – T gehalte, waardoor het makkelijk breekt en
bestaat uit honderden of duizenden korte identieke
sequenties die betrokken zijn bij het paren of uit elkaar halen
van de chromosomen bij de celdeling.
Mitochondriaal DNA → DNA van het mitochondrium zelf.
Mitochondriën hebben een apart genoom en bevatten tRNA’s,
rRNA’s en dertien genen die betrokken zijn bij de
energievoorziening van de cel.
Opbouw RNA
Er zijn een aantal verschillen tussen DNA en RNA:
- De thymine (T) nucleotide wordt in RNA vervangen
door een uracil (U) nucleotide
- In RNA bevindt zich een ander suikermolecuul,
genaamd ribose (ipv desoxyribose). Bij ribose zit aan
het tweede koolstofatoom een OH-groep.
- RNA is enkelstrengs
- RNA kent geen vaste hoeveelheid. Er wordt
doorlopend nieuw RNA gemaakt en afgebroken.
Soorten RNA
Ribosomaal RNA (rRNA) → 80%, bouwsteen voor ribosomen,
zorgt tijdens de translatie voor vorming peptidebindingen tussen aminozuren.
Transfer RNA (tRNA) → 15%, specifieke structuur (klaverblad). Elk tRNA molecuul heeft voor één
specifiek aminozuur een bindingsplaats. Het bevat een anticodon die dient om het aminozuur in het
ribosoom tijdelijk te laten binden met een bijbehorend codon (=nucleotidevolgorde) op het mRNA.
Er zijn geen tRNA moleculen die een stopcodon herkennen (UGA, UAA, UAG). De anticodons van
sommige tRNA’s kunnen meer dan 1 codon herkennen. De tRNA’s hebben een eigen bindingplaats in
het ribosoom: de A-site.
Messenger RNA (mRNA) → 5%, codeert voor eiwitten
Micro RNA (miRNA) → reguleren de genexpressie
Ander niet-coderend RNA → wordt gebruikt bij RNA-splitsing, genregulatie, dienen als telomeren en
andere processen.
,3. Hoe werkt het gedetailleerde proces van DNA-replicatie?
Wanneer cellen delen, moeten de dochtercellen hetzelfde DNA bevatten. DNA-replicatie begint in de
S-fase van de celcyclus en gaat door tot al het DNA is gerepliceerd. Het DNA is erg lang en replicatie
begint dan ook tegelijkertijd op verschillende origins of replication.
1. Openen van de gecondenseerde chromosomen, zodat deze toegankelijk wordt voor
enzymen en andere eiwitten → d.m.v. acetylering en deacetylering van de histonen
2. Ontspanning van de hogere DNA-structuren → topoisomerases zijn enzymen die de
ontspanning van supercoiling in DNA mogelijk maken. Het DNA wordt dus uit elkaar gedraaid
door topoisomerase.
3. Het afwikkelen van de dubbele helix van DNA → De replicatie begint bij een bepaalde
nucleotidenvolgorde in het DNA: the origin of replication. De zwakke waterstofbruggen
tussen de basen van de DNA-helix worden hier verbroken door het enzym helicase,
waardoor twee enkele strengen DNA ontstaan. De energie die hiervoor nodig is wordt
gehaald uit de hydrolyse van ATP. Door de opening van het DNA ontstaan er twee
replicatievorken die in tegengestelde richting van de origin of replication af bewegen
(=bidirectioneel). De gevormde vorken zijn asymmetrisch, de ene nieuwe DNA-keten wordt
gevormd in de 3’-5’ richting, de andere in de 5’-3’ richting.
4. Primers/primases → primers zijn korte – 4 tot 15 nucleotiden lange – stukjes RNA. Zij zijn
nodig om de synthese van beide dochterstrengen op gang te brengen. Het enzym dat deze
synthese katalyseert, wordt primase genoemd. Primases vormen complexen met DNA-
polymerase in eukaryoten. Primers worden ongeveer om de 50 nucleotiden in de lagging
streng synthese geplaatst.
5. DNA-polymerase → de belangrijkste enzymen bij de replicatie zijn de DNA-polymerasen. Het
bindt aan de beide replicatievorken en synthetiseer nieuw DNA door de oude streng als
template te gebruiken. DNA-polymerase katalyseert de toevoeging van een nieuw nucleotide
aan het 3’uiteinde. Dit gebeurt door een fosfodi-esterbinding tussen het 3’ uiteinde en de 5’-
fosfaatgroep te plaatsen, waarbij ATP wordt verbruikt. De replicatie verloopt altijd van de 5'
naar de 3' richting vanuit het perspectief van de keten die wordt gesynthetiseerd.
Zodra de twee strengen bij de replicatievork gescheiden zijn, moeten de DNA-nucleotiden op
een rij worden gezet. Alle vier de vrije nucleotiden zijn aanwezig in de nabijheid van de
replicatievork. Zij proberen zich voortdurend in te passen in de nieuwe ketens. DNA-
polymerase versnelt dit proces aanzienlijk. De polymerasen verbinden de nucleotiden
backbone.
DNA-polymerase kan alleen een nucleotide aan het 3' uiteinde vastmaken als er al een DNA-
streng is. Het kan niet de vorming van een nieuwe streng starten. Daarvoor zorgt een RNA-
polymerase, welke een RNA-primer vormt van ongeveer 10 nucleotiden, complementair aan
de DNA-streng Het DNA-polymerase kan vervolgens nucleotiden aan die RNA-primer
toevoegen zodat een complementaire DNA-streng ontstaat.
Langs de lagging streng 3’→5’ kunnen de enzymen slechts korte fragmenten synthetiseren,
omdat zij alleen van 5’ naar 3’ kunnen werken. Deze korte fragmenten bestaan bij
eukaryoten elk uit ongeveer 200 nucleotiden = Okazaki fragmenten.
6. Ligatie → de Okazaki fragmenten en de eventueel overblijvende inkepingen worden
uiteindelijk samengevoegd door een ander enzym, DNA-ligase. Aan het eind van het proces
zijn er twee dubbelstrengs DNA-moleculen, elk precies gelijk aan het oorspronkelijke
molecuul.
Het 3' uiteinde van de beide strengen van het DNA liggen in tegenovergestelde richtingen. Hierdoor
verloopt de replicatie van beide strengen op verschillende manieren. Bij de leidende streng (leading
,strand of de anti-sense) wordt aan het 3' uiteinde continu een DNA-nucleotide toegevoegd in de
richting van de replicatievork.
In de andere streng, de sense streng, is de groeirichting juist van de replicatievork af. Er worden
steeds nieuwe stukjes gesynthetiseerd. Deze nieuwe stukjes worden Okazaki-fragmenten genoemd.
Om de replicatie sneller te laten verlopen, worden replicatie sprongen (replication origins) gemaakt.
De replicatie begint dus tegelijk op verschillende punten in het DNA-molecuul. De DNA-streng die
met behulp van Okazaki-fragmenten wordt gerepliceerd heet de lagging strand.
Om vervolgens een continue DNA-streng te krijgen zijn drie enzymen nodig:
- Nuclease → breekt de RNA-primer af.
- Repair polymerase → vervangt het RNA door DNA. De okazaki fragmenten worden hierbij als
primer gebruikt.
- DNA-ligase → verbindt vervolgens het 5' einde van het ene okazaki fragment met het 3'
einde van het volgende okazaki fragment. Voor deze reactie is de hydrolyse van ATP of NADH
noodzakelijk.
DNA-polymerase kan ook fouten in de DNA-replicatie herkennen en corrigeren. Dit wordt
proofreading genoemd. DNA-polymerase kan dit alleen als het een nieuwe streng in de 5' naar 3
richting vormt.
Aan het einde van de chromosomen zorgen telomeren ervoor dat ook hier replicatie kan
plaatsvinden, Zonder deze telomeren zouden de DNA-strengen na elke replicatie een stuk korter
worden. Aan het uiteinde van de DNA-streng is namelijk geen plek om een RNA-primer te plaatsen.
Daarom zitten er aan het einde van de DNA-streng speciale nucleotiden, de telomeren, die het
enzym telomerase aantrekken. Dit is een enzym die kopieën van dezelfde telomeer nucleotiden het
einde van het chromosoom plakt. Hierdoor ontstaat een template die het mogelijk maakt de
replicatie van de lagging strand af te maken.
Het eindresultaat is dat er twee DNA-moleculen zijn gevormd uit één oorspronkelijk DNA molecuul
(de template strengen) en ze identiek hieraan zijn. Elk nieuw DNA-molecuul bestaat uit één oude en
één nieuwe nucleotide streng. Daarom wordt dit mechanisme van DNA-replicatie ook wel semi
conservatieve replicatie genoemd.
,SSB houdt helix open, DNA polymerase III maakt eerst DNA, DNA polymerase I haalt de primers eruit
en vult gaten op met DNA
4. Hoe werkt transcriptie en translatie (basic)?
Transcriptie
RNA wordt altijd van 5’ naar 3’ gesynthetiseerd. Er is geen primer (start enzym) nodig bij de synthese
van RNA. Voor de transcriptie van de verschillende soorten RNA bestaan drie enzymen:
- RNA polymerase I → rRNA
- RNA polymerase II → mRNA
- RNA polymerase III → tRNA
Polymerase I en III zijn verantwoordelijk voor de transcriptie van de genen die coderen voor tRNA,
rRNA en verschillende andere RNA’s die structureel een rol spelen in de cel.
Polymerase II is verantwoordelijk voor de transcriptie van de grote meerderheid van de genen die
coderen voor eiwitten (mRNA) en het reguleren van genexpressie (miRNA).
RNA polymerase heeft verschillende functies:
- Herkenning van het begin en eind van een gen
- Lokale ontbinding van de DNA-helix
- Selectie van DNA template streng
- Synthese van complementaire RNA streng
- Sluiten van DNA helix
De transcriptie start wanneer een RNA-polymerase aan de promotorregio (start site) van een gen
bindt (initiatie). Alleen de niet-coderende streng (template streng/matrijsstreng/leading strand) van
het DNA wordt afgelezen. De RNA-polymerase leest de nucleotidenvolgorde af om een pre-mRNA-
molecuul te synthetiseren. Terminatie van de transcriptie vindt plaats door vele C – G verbindingen
in het DNA. Deze zijn lastig uit elkaar te halen, waardoor de RNA streng loslaat.
Het pre-mRNA-molecuul bestaat maar kort. Zodra een 5’-cap op het molecuul is gezet, de intronen
eruit zijn gehaald (splicing) en aan het 3’ uiteinde een poly-A-staart (staart van
adenosinenucleotiden) is geplakt, kan het mRNA als af worden beschouwd.
Translatie
Naast de DNA-replicatie in de nucleus, vindt er ook eiwitsynthese plaats in het cytoplasma. De
genetische informatie in het DNA wordt door middel van mRNA naar het cytoplasma
getransporteerd. Na de transcriptie verlaten die mRNA-moleculen de celkern en verplaatsen ze zich
naar andere delen van de cel, bv naar het cytoplasma of naar het ER. Daar worden ze vertaald in
aaneengeschakelde aminozuren (translatie), wat een polypeptide vormt, die vaak in een
driedimensionale structuur geplooid wordt om een eiwit te vormen.
Een ribosoom heeft drie sites:
- A-site → aminozuur wordt hier gebonden aan ribosoom (aankomst)
- P-site → ketting van polymeren
- E-site → ribosoom schuift een plaats verder op (exit)
5. Welke technieken kunnen gebruikt worden om de genetische code te achterhalen?
Er zijn verschillende onderzoekstechnieken om genetische variatie te onderzoeken:
- Eiwitelektroforese (protein electrophoresis) → Deze methode maakt gebruik van het feit dat
één verandering van aminozuur binnen een eiwit een lichte verandering in de elektrische
, lading van het eiwit kan veroorzaken. Eiwitten met deze lichte verandering in hun aminozuur
reeks zullen anders migreren door een elektrisch geladen gel. De ene kant van de gel is
positief geladen en de andere kant negatief geladen. Afhankelijk van de lading van het eiwit
zal het dus dichter bij de positief of negatief geladen kant terechtkomen.
- Gelelektroforese → DNA wordt in een gel gedaan, nadat het in stukjes is geknipt en is
vermeerderd. Hierna wordt de bak met gel onder stroom gezet. Aangezien de DNA-stukjes
lichtelijk negatief zijn, doordat er waterstofatomen zijn losgekomen van de fosfaatgroepen,
zullen deze naar de positieve pool bewegen. Grote stukken DNA zullen uiteraard langzamer
gaan dan kleinere stukken DNA.
Ook kan variatie op DNA-niveau worden gevonden. Technieken die hiervoor gebruikt worden zijn:
- Southern blotting en restrictiefragment analyse → hierbij wordt gebruik gemaakt van
bacteriële enzymen. Deze enzymen splijten specifieke reeksen van menselijk DNA. Deze
reeksen worden de restrictieplaatsen genoemd. Zo wordt het DNA in fragmenten geknipt.
Deze fragmenten worden vervolgens door middel van elektroforese gesorteerd op hun
lengte.
Vervolgens worden ze overgedragen naar een solide membraan (southern blotting), waar ze
worden gevisualiseerd door gelabelde probes te gebruiken. Met dit proces kunnen
verwijderingen of verdubbelingen van DNA worden gevonden, net zoals polymorfismen in de
restrictieplaatsen.
PCR-methode
DNA-moleculen zijn erg klein, dus moeten er erg veel kopieën worden gemaakt om DNA-variatie
zichtbaar te maken. Hiervoor wordt het proces PCR (polymerase chain reaction) gebruikt. Voor PCR
zijn twee primers, taq-polymerase (DNA-polymerase), veel vrije nucleotiden en genomisch DNA van
een individu nodig. Het DNA wordt eerst sterk verhit tot 95˚C. Hierdoor gaan de strengen uit elkaar.
Dit proces wordt denaturatie genoemd. Vervolgens wordt het afgekoeld tot ongeveer 55˚C. Het DNA
wordt nu blootgesteld aan hoge aantallen enkelstrengse primers. De primers hechten aan passende
stukken DNA, dit proces heet hybridisatie. Het DNA wordt daarna weer verhit tot 72˚C en in
aanwezigheid van de vrije stikstofbasen wordt een complementaire DNA-streng gevormd door taq-
polymerase, deze is bestendigd tegen hoge temperaturen en dus denatureert het niet. Het
nieuwgevormde dubbelstrengs DNA (dsDNA) wordt hierna opnieuw verhit. De twee strengen
denatureren vervolgens weer. Het hele proces kan zo herhaald worden, waarbij het aantal DNA-
strengen exponentieel toeneemt.
Hoge temperatuur verbreekt waterstofbruggen van de helix. Taq-polymerase uit bacterie gehaald
want bestand tegen hoge temperatuur.
Casus 1
1. Wat is de algemene structuur van de cel?
Organismen waarvan cellen een nucleus/celkern bevatten, worden eukaryoten genoemd.
Organismen waarvan cellen geen nucleus bevatten, worden prokaryoten genoemd. Onder de
prokaryoten vallen de bacteriën en de archaea (eencellige micro-organismen). De cellen van de mens
zijn eukaryotisch.
Organellen in de eukaryotische cel
Organellen zijn delen van een cel met bepaalde functies, die door membranen
worden begrensd (uitzondering = ribosomen).
- Nucleus → belangrijkste organel. Hierin ligt alle genetische informatie
van de cel opgeslagen. De nucleus bevat DNA-moleculen en wordt
omgeven door een dubbel membraan, de nucleaire envelop. Het
nucleoplasma is het vloeibare deel van de celkern.
- Nucleolus → (kernlichaam) ligt in de nucleus. Hierin wordt rRNA
gemaakt.
- Mitochondriën → regelen de energievoorziening van de cel. Dit doen
ze door voedselmoleculen te oxideren waarbij ATP ontstaat
(=oxidatieve fosforylering). ATP is de algemene brandstof van de cel.
Mitochondriën gebruiken zuurstof en geven CO2 af (=cellulaire
ademhaling). Mitochondriën bevatten twee aparte membranen,
waarvan de binnenste gevouwen is om het oppervlak zo groot
mogelijk te maken. Verder bevatten ze hun eigen DNA. Ze
reproduceren zich door zichzelf in tweeën te delen.
- Endoplasmatisch reticulum (ER) → onregelmatig doolhof van
onderling verbonden ruimten, ingesloten door een membraan.
Hier worden de meeste celmembraan-onderdelen en
exportproducten van de cel gemaakt. Er zijn twee soorten:
1. Het ruw ER (RER). Op het ruw ER liggen ribosomen, deze
zorgen voor het maken van eiwitten, door aminozuren aan
elkaar te koppelen.
2. Het glad ER (SER). Het glad ER zorgt voornamelijk voor
stofwisselingsprocessen in de cel. In sommige cellen maakt
het schadelijke stoffen onschadelijk en in andere cellen maakt
het bijvoorbeeld vetten.
- Golgi Apparaat → bestaat uit schoteltjes van membranen die op elkaar zijn gestapeld. Dit
bewerkt en verpakt ER-moleculen die naar een andere cel of naar een ander organel moeten
worden getransporteerd.
, - Lysosomen → kleine, onregelmatig gevormde organellen, die
verteringsenzymen bevatten. Er vindt intracellulaire vertering
plaats: ze geven de voedingsstoffen uit opgenomen
voedseldeeltjes vrij en breken de niet-gewenste moleculen af.
Deze niet-gewenste moleculen worden gerecycled of
uitgescheiden.
- Peroxisomen → kleine door een membraan ingesloten blaasjes.
Ze zorgen voor een veilige omgeving voor diverse reacties.
Waterstofperoxide wordt hierbij gebruikt om toxische moleculen
te inactiveren.
- Ribosomen → het meest voorkomende organel. Er zijn twee
types, een bevindt zich vrij in het cytoplasma en de ander zit vast
aan het ER. Ribosomen zijn de plek voor proteïne synthese.
Tussen het ER, het Golgi Apparaat en de lysosomen vindt voortdurend transport plaats. Dit transport
verloopt via transportblaasjes, door middel van endocytose (=opname van stoffen buiten de cel) en
exocytose (=afgifte van stoffen uit de cel). Endo- en exocytose worden ook gebruikt om materiaal de
cel in of uit te transporteren.
- Vesicles → opslag voor stoffen die van het glad ER en het Golgi Apparaat afkomen.
Cytoplasma en cytoskelet van de cel
Het cytoplasma is de vloeistof in een cel. Het is een geconcentreerde oplossing van grote en kleine
moleculen waar veel chemische reacties plaatsvinden. Hier wordt de eerste stap gemaakt in het
afbreken van voedselmoleculen en worden de meeste eiwitten gemaakt. De productie van eiwitten
wordt gedaan door de ribosomen van het RER.
Het cytoplasma is de verzamelterm voor het cytosol en alle celorganellen afgezien van het
celmembraan en de kern. Het cytosol is de vloeistof waarin de celorganellen liggen. Het bestaat
voornamelijk uit water, ionen, macromoleculen en metabolieten.
,Het cytoplasma is structureel opgebouwd door middel van het cytoskelet. Dit is een systeem van
eiwitdraden die vaak geankerd zitten aan het plasmamembraan en de nucleus. Er zijn drie soorten
eiwitdraden:
- Microfilamenten → (actinedraden) dit zijn de dunste draden en komen veel in spiercellen
voor. Het is het centrale deel in het mechanisme, het draagt de spanning van de cel en is
verantwoordelijk voor cel beweging en cel vorm.
- Microtubuli → dit zijn de dikste draden en lijken op holle buizen. Ze zijn nauw betrokken bij
de celdeling en zorgen voor transport van moleculen. Bepalen de algemene vorm van de cel
en de verspreiding van de celorganellen.
- Intermediaire draden → deze verstevigen de cel.
Aan deze drie draden zitten vaak nog andere eiwitten bevestigd. Samen vormen ze een systeem van
balken, touwen en motoren die de cel zijn mechanische kracht en vormgeeft en zorgt voor de
bewegingen van de cel. De binnenkant van een cel is constant in beweging. Motoreiwitten gebruiken
de energie van ATP om organellen en eiwitten door het cytoplasma te dragen en te verplaatsen door
de hele cel binnen enkele seconden (over de microtubuli heen).
Centrosoom en centriolen
Centriolen bestaan uit 9 triplets van microtubuli en zijn voornamelijk betrokken bij de celdeling. De
centriolen zijn aan een uiteinde geankerd aan een regio bij de nucleus genaamd het centrosoom. De
centrosoommatrix is het meest bekend voor het genereren van microtubuli en het organiseren van
de mitotische spindel bij de celdeling.
Centriolen vormen ook de basis van cilia en flagella:
- Cilia → zweepvormige, beweeglijke cel uitsteeksels die meestal in grote aantallen
voorkomen op blootgestelde oppervlakten van bepaalde cellen. Door de werking van deze
trilharen worden stoffen in één richting over cel oppervlakten bewogen.
- Flagella → uitsteeksels gevormd door centriolen. Ze zijn langer dan cilia. (alleen bij sperma
cel). Beweegt de cel zelf voort.
Celmembraan
Het celmembraan vormt de scheiding tussen het interne en externe milieu van de
cel. Het doel van het celmembraan is om ongewenste stoffen buiten de cel en
gewenste stoffen binnen de cel te houden. Het celmembraan is permeabel omdat
het voor bepaalde stoffen doorlaatbaar is. Het celmembraan bestaat uit een
dubbele laag fosfolipiden. Een fosfolipide is een amfipatisch molecuul: het bestaat
uit een apolair vetzuur (de staart) en een hydrofiele kop. In het celmembraan
zitten de apolaire staarten naar elkaar toe gericht en steken de polaire koppen
naar buiten. Dit komt doordat de polaire koppen zich aangetrokken voelen tot het
water waaruit cytoplasma grotendeels bestaat en de apolaire vetzuren zullen zich afstoten hiervan.
,In of op het celmembraan zitten ook een
heleboel eiwitten. De functie van deze eiwitten
is o.a het reguleren en faciliteren van het
transport van de stoffen. Daarnaast zorgen ze
voor de signaaloverdracht in de cel.
Naast fosfolipiden is cholesterol een belangrijke
bouwsteen van het celmembraan.
2. Wat is de gedetailleerde structuur van
DNA en RNA
Genoom → Het genoom beschrijft de combinatie van alle erfelijke factoren. Onder het genoom
wordt één complete set van chromosomen verstaan.
De chromosomen bestaan uit opgerold DNA. In niet-delende cellen is dit DNA niet zichtbaar en wordt
het chromatine genoemd. Vlak voordat een cel gaat delen, condenseert het DNA en worden het
chromosomen genoemd. 95% van het DNA is niet coderend junk-DNA.
Opbouw DNA
Elk DNA-molecuul is een polymeerketen dat wordt opgebouwd uit vier verschillende nucleotiden.
Een nucleotide is de combinatie van een fosfaatgroep, een desoxyribose (suikergroep) en een
stikstofbase (G,A,T,C).
De basen:
- Guanine (G) → purine
- Adenine (A) → purine
- Thymine (T) → pyrimidine
- Cytosine (C) → pyrimidine
Suikergroep:
DNA → desoxyribose (geen zuurstofatoom aan het tweede
koolstofatoom aanwezig, alleen een waterstofatoom)
Fosfaatgroep:
Vormt een fosfaat-esterverbinding met een nucleoside →
nucleotide
➔ Houdt het geheel bij elkaar en wordt daarom ook fosfaat
backbone genoemd.
A nucleoside = Base + Suiker
A nucleotide = Base + Suiker + Fosfaat
A nucleic acid = A chain of nucleotides
Ruimtelijke bouw
Het DNA heeft een dubbele helixstructuur. De twee zijkanten van
de ladder bestaan uit een suiker (desoxyribose) en de
fosfaatgroepen. Tussen de zijkanten lopen treden. Elke tree bestaat uit twee basen, waarvan beide
vastzitten aan een andere zijkant.
De basen en strengen zijn complementair aan elkaar. Er zijn twee vaste basenparen: G – C (3
waterstofbruggen) en A – T (2 waterstofbruggen). Het verschil in waterstofbruggen zorgt voor een
niet volledig symmetrische DNA-helix. De centrale as van de helix bevindt zich niet precies in het
,midden, waardoor een major groove en een minor groove ontstaat. De major groove is
toegankelijker voor eiwitten van buitenaf. De twee strengen hebben een tegenovergestelde
polariteit (richting). Dat houdt in dat het 5’-uiteinde altijd tegenover het 3’-uiteinde ligt.
4 soorten structuren:
1. Primaire structuur → hierbij wordt het DNA weergegeven met de fosfaatgroepen, de
suikergroepen en de volgorde van de basen.
2. Secundaire structuur → hierbij wordt het DNA
weergegeven in een dubbele helix, tot stand gekomen
door waterstofbruggen.
3. Tertiaire structuur → hierbij wordt de interactie tussen
delen van een polypeptide weergegeven. Er kunnen
tussen deze delen zwavelbruggen ontstaan.
4. Quaternaire structuur → hierbij wordt de interactie
tussen meerdere polypeptiden weergegeven.
DNA vormt nucleosomen doordat het DNA om histoneiwitkernen
(histonen) wordt gewonden. Deze nucleosomen vormen
vervolgens een spiraalvormige solenoïde. Deze solenoïden zijn
opgerold tot het uiteindelijke chromosoom.
Soorten DNA
Chromosomen → Chromosomen bestaan uit coderende genen
(exonen) en ‘nonsense-DNA’ of ‘junk-DNA’ (intronen). Nonsense-DNA is belangrijk voor de regulatie
van genen (genexpressie).
,Repeat sequenties → stukjes DNA die heel vaak herhaald
worden. Zulke repetitive repeats bestaan uit een gen dat
meerdere keren achter elkaar herhaald wordt, omdat er veel
van nodig is (bijvoorbeeld tRNA en rRNA).
- Middle repetitive → enkele repeats achter elkaar
- Highly repetitive → een hele rij van repeats achter
elkaar
Satelliet DNA → bevindt zich aan de uiteinden van
chromosomen en is te zien als een soort antennes. Het heeft
een hoog A – T gehalte, waardoor het makkelijk breekt en
bestaat uit honderden of duizenden korte identieke
sequenties die betrokken zijn bij het paren of uit elkaar halen
van de chromosomen bij de celdeling.
Mitochondriaal DNA → DNA van het mitochondrium zelf.
Mitochondriën hebben een apart genoom en bevatten tRNA’s,
rRNA’s en dertien genen die betrokken zijn bij de
energievoorziening van de cel.
Opbouw RNA
Er zijn een aantal verschillen tussen DNA en RNA:
- De thymine (T) nucleotide wordt in RNA vervangen
door een uracil (U) nucleotide
- In RNA bevindt zich een ander suikermolecuul,
genaamd ribose (ipv desoxyribose). Bij ribose zit aan
het tweede koolstofatoom een OH-groep.
- RNA is enkelstrengs
- RNA kent geen vaste hoeveelheid. Er wordt
doorlopend nieuw RNA gemaakt en afgebroken.
Soorten RNA
Ribosomaal RNA (rRNA) → 80%, bouwsteen voor ribosomen,
zorgt tijdens de translatie voor vorming peptidebindingen tussen aminozuren.
Transfer RNA (tRNA) → 15%, specifieke structuur (klaverblad). Elk tRNA molecuul heeft voor één
specifiek aminozuur een bindingsplaats. Het bevat een anticodon die dient om het aminozuur in het
ribosoom tijdelijk te laten binden met een bijbehorend codon (=nucleotidevolgorde) op het mRNA.
Er zijn geen tRNA moleculen die een stopcodon herkennen (UGA, UAA, UAG). De anticodons van
sommige tRNA’s kunnen meer dan 1 codon herkennen. De tRNA’s hebben een eigen bindingplaats in
het ribosoom: de A-site.
Messenger RNA (mRNA) → 5%, codeert voor eiwitten
Micro RNA (miRNA) → reguleren de genexpressie
Ander niet-coderend RNA → wordt gebruikt bij RNA-splitsing, genregulatie, dienen als telomeren en
andere processen.
,3. Hoe werkt het gedetailleerde proces van DNA-replicatie?
Wanneer cellen delen, moeten de dochtercellen hetzelfde DNA bevatten. DNA-replicatie begint in de
S-fase van de celcyclus en gaat door tot al het DNA is gerepliceerd. Het DNA is erg lang en replicatie
begint dan ook tegelijkertijd op verschillende origins of replication.
1. Openen van de gecondenseerde chromosomen, zodat deze toegankelijk wordt voor
enzymen en andere eiwitten → d.m.v. acetylering en deacetylering van de histonen
2. Ontspanning van de hogere DNA-structuren → topoisomerases zijn enzymen die de
ontspanning van supercoiling in DNA mogelijk maken. Het DNA wordt dus uit elkaar gedraaid
door topoisomerase.
3. Het afwikkelen van de dubbele helix van DNA → De replicatie begint bij een bepaalde
nucleotidenvolgorde in het DNA: the origin of replication. De zwakke waterstofbruggen
tussen de basen van de DNA-helix worden hier verbroken door het enzym helicase,
waardoor twee enkele strengen DNA ontstaan. De energie die hiervoor nodig is wordt
gehaald uit de hydrolyse van ATP. Door de opening van het DNA ontstaan er twee
replicatievorken die in tegengestelde richting van de origin of replication af bewegen
(=bidirectioneel). De gevormde vorken zijn asymmetrisch, de ene nieuwe DNA-keten wordt
gevormd in de 3’-5’ richting, de andere in de 5’-3’ richting.
4. Primers/primases → primers zijn korte – 4 tot 15 nucleotiden lange – stukjes RNA. Zij zijn
nodig om de synthese van beide dochterstrengen op gang te brengen. Het enzym dat deze
synthese katalyseert, wordt primase genoemd. Primases vormen complexen met DNA-
polymerase in eukaryoten. Primers worden ongeveer om de 50 nucleotiden in de lagging
streng synthese geplaatst.
5. DNA-polymerase → de belangrijkste enzymen bij de replicatie zijn de DNA-polymerasen. Het
bindt aan de beide replicatievorken en synthetiseer nieuw DNA door de oude streng als
template te gebruiken. DNA-polymerase katalyseert de toevoeging van een nieuw nucleotide
aan het 3’uiteinde. Dit gebeurt door een fosfodi-esterbinding tussen het 3’ uiteinde en de 5’-
fosfaatgroep te plaatsen, waarbij ATP wordt verbruikt. De replicatie verloopt altijd van de 5'
naar de 3' richting vanuit het perspectief van de keten die wordt gesynthetiseerd.
Zodra de twee strengen bij de replicatievork gescheiden zijn, moeten de DNA-nucleotiden op
een rij worden gezet. Alle vier de vrije nucleotiden zijn aanwezig in de nabijheid van de
replicatievork. Zij proberen zich voortdurend in te passen in de nieuwe ketens. DNA-
polymerase versnelt dit proces aanzienlijk. De polymerasen verbinden de nucleotiden
backbone.
DNA-polymerase kan alleen een nucleotide aan het 3' uiteinde vastmaken als er al een DNA-
streng is. Het kan niet de vorming van een nieuwe streng starten. Daarvoor zorgt een RNA-
polymerase, welke een RNA-primer vormt van ongeveer 10 nucleotiden, complementair aan
de DNA-streng Het DNA-polymerase kan vervolgens nucleotiden aan die RNA-primer
toevoegen zodat een complementaire DNA-streng ontstaat.
Langs de lagging streng 3’→5’ kunnen de enzymen slechts korte fragmenten synthetiseren,
omdat zij alleen van 5’ naar 3’ kunnen werken. Deze korte fragmenten bestaan bij
eukaryoten elk uit ongeveer 200 nucleotiden = Okazaki fragmenten.
6. Ligatie → de Okazaki fragmenten en de eventueel overblijvende inkepingen worden
uiteindelijk samengevoegd door een ander enzym, DNA-ligase. Aan het eind van het proces
zijn er twee dubbelstrengs DNA-moleculen, elk precies gelijk aan het oorspronkelijke
molecuul.
Het 3' uiteinde van de beide strengen van het DNA liggen in tegenovergestelde richtingen. Hierdoor
verloopt de replicatie van beide strengen op verschillende manieren. Bij de leidende streng (leading
,strand of de anti-sense) wordt aan het 3' uiteinde continu een DNA-nucleotide toegevoegd in de
richting van de replicatievork.
In de andere streng, de sense streng, is de groeirichting juist van de replicatievork af. Er worden
steeds nieuwe stukjes gesynthetiseerd. Deze nieuwe stukjes worden Okazaki-fragmenten genoemd.
Om de replicatie sneller te laten verlopen, worden replicatie sprongen (replication origins) gemaakt.
De replicatie begint dus tegelijk op verschillende punten in het DNA-molecuul. De DNA-streng die
met behulp van Okazaki-fragmenten wordt gerepliceerd heet de lagging strand.
Om vervolgens een continue DNA-streng te krijgen zijn drie enzymen nodig:
- Nuclease → breekt de RNA-primer af.
- Repair polymerase → vervangt het RNA door DNA. De okazaki fragmenten worden hierbij als
primer gebruikt.
- DNA-ligase → verbindt vervolgens het 5' einde van het ene okazaki fragment met het 3'
einde van het volgende okazaki fragment. Voor deze reactie is de hydrolyse van ATP of NADH
noodzakelijk.
DNA-polymerase kan ook fouten in de DNA-replicatie herkennen en corrigeren. Dit wordt
proofreading genoemd. DNA-polymerase kan dit alleen als het een nieuwe streng in de 5' naar 3
richting vormt.
Aan het einde van de chromosomen zorgen telomeren ervoor dat ook hier replicatie kan
plaatsvinden, Zonder deze telomeren zouden de DNA-strengen na elke replicatie een stuk korter
worden. Aan het uiteinde van de DNA-streng is namelijk geen plek om een RNA-primer te plaatsen.
Daarom zitten er aan het einde van de DNA-streng speciale nucleotiden, de telomeren, die het
enzym telomerase aantrekken. Dit is een enzym die kopieën van dezelfde telomeer nucleotiden het
einde van het chromosoom plakt. Hierdoor ontstaat een template die het mogelijk maakt de
replicatie van de lagging strand af te maken.
Het eindresultaat is dat er twee DNA-moleculen zijn gevormd uit één oorspronkelijk DNA molecuul
(de template strengen) en ze identiek hieraan zijn. Elk nieuw DNA-molecuul bestaat uit één oude en
één nieuwe nucleotide streng. Daarom wordt dit mechanisme van DNA-replicatie ook wel semi
conservatieve replicatie genoemd.
,SSB houdt helix open, DNA polymerase III maakt eerst DNA, DNA polymerase I haalt de primers eruit
en vult gaten op met DNA
4. Hoe werkt transcriptie en translatie (basic)?
Transcriptie
RNA wordt altijd van 5’ naar 3’ gesynthetiseerd. Er is geen primer (start enzym) nodig bij de synthese
van RNA. Voor de transcriptie van de verschillende soorten RNA bestaan drie enzymen:
- RNA polymerase I → rRNA
- RNA polymerase II → mRNA
- RNA polymerase III → tRNA
Polymerase I en III zijn verantwoordelijk voor de transcriptie van de genen die coderen voor tRNA,
rRNA en verschillende andere RNA’s die structureel een rol spelen in de cel.
Polymerase II is verantwoordelijk voor de transcriptie van de grote meerderheid van de genen die
coderen voor eiwitten (mRNA) en het reguleren van genexpressie (miRNA).
RNA polymerase heeft verschillende functies:
- Herkenning van het begin en eind van een gen
- Lokale ontbinding van de DNA-helix
- Selectie van DNA template streng
- Synthese van complementaire RNA streng
- Sluiten van DNA helix
De transcriptie start wanneer een RNA-polymerase aan de promotorregio (start site) van een gen
bindt (initiatie). Alleen de niet-coderende streng (template streng/matrijsstreng/leading strand) van
het DNA wordt afgelezen. De RNA-polymerase leest de nucleotidenvolgorde af om een pre-mRNA-
molecuul te synthetiseren. Terminatie van de transcriptie vindt plaats door vele C – G verbindingen
in het DNA. Deze zijn lastig uit elkaar te halen, waardoor de RNA streng loslaat.
Het pre-mRNA-molecuul bestaat maar kort. Zodra een 5’-cap op het molecuul is gezet, de intronen
eruit zijn gehaald (splicing) en aan het 3’ uiteinde een poly-A-staart (staart van
adenosinenucleotiden) is geplakt, kan het mRNA als af worden beschouwd.
Translatie
Naast de DNA-replicatie in de nucleus, vindt er ook eiwitsynthese plaats in het cytoplasma. De
genetische informatie in het DNA wordt door middel van mRNA naar het cytoplasma
getransporteerd. Na de transcriptie verlaten die mRNA-moleculen de celkern en verplaatsen ze zich
naar andere delen van de cel, bv naar het cytoplasma of naar het ER. Daar worden ze vertaald in
aaneengeschakelde aminozuren (translatie), wat een polypeptide vormt, die vaak in een
driedimensionale structuur geplooid wordt om een eiwit te vormen.
Een ribosoom heeft drie sites:
- A-site → aminozuur wordt hier gebonden aan ribosoom (aankomst)
- P-site → ketting van polymeren
- E-site → ribosoom schuift een plaats verder op (exit)
5. Welke technieken kunnen gebruikt worden om de genetische code te achterhalen?
Er zijn verschillende onderzoekstechnieken om genetische variatie te onderzoeken:
- Eiwitelektroforese (protein electrophoresis) → Deze methode maakt gebruik van het feit dat
één verandering van aminozuur binnen een eiwit een lichte verandering in de elektrische
, lading van het eiwit kan veroorzaken. Eiwitten met deze lichte verandering in hun aminozuur
reeks zullen anders migreren door een elektrisch geladen gel. De ene kant van de gel is
positief geladen en de andere kant negatief geladen. Afhankelijk van de lading van het eiwit
zal het dus dichter bij de positief of negatief geladen kant terechtkomen.
- Gelelektroforese → DNA wordt in een gel gedaan, nadat het in stukjes is geknipt en is
vermeerderd. Hierna wordt de bak met gel onder stroom gezet. Aangezien de DNA-stukjes
lichtelijk negatief zijn, doordat er waterstofatomen zijn losgekomen van de fosfaatgroepen,
zullen deze naar de positieve pool bewegen. Grote stukken DNA zullen uiteraard langzamer
gaan dan kleinere stukken DNA.
Ook kan variatie op DNA-niveau worden gevonden. Technieken die hiervoor gebruikt worden zijn:
- Southern blotting en restrictiefragment analyse → hierbij wordt gebruik gemaakt van
bacteriële enzymen. Deze enzymen splijten specifieke reeksen van menselijk DNA. Deze
reeksen worden de restrictieplaatsen genoemd. Zo wordt het DNA in fragmenten geknipt.
Deze fragmenten worden vervolgens door middel van elektroforese gesorteerd op hun
lengte.
Vervolgens worden ze overgedragen naar een solide membraan (southern blotting), waar ze
worden gevisualiseerd door gelabelde probes te gebruiken. Met dit proces kunnen
verwijderingen of verdubbelingen van DNA worden gevonden, net zoals polymorfismen in de
restrictieplaatsen.
PCR-methode
DNA-moleculen zijn erg klein, dus moeten er erg veel kopieën worden gemaakt om DNA-variatie
zichtbaar te maken. Hiervoor wordt het proces PCR (polymerase chain reaction) gebruikt. Voor PCR
zijn twee primers, taq-polymerase (DNA-polymerase), veel vrije nucleotiden en genomisch DNA van
een individu nodig. Het DNA wordt eerst sterk verhit tot 95˚C. Hierdoor gaan de strengen uit elkaar.
Dit proces wordt denaturatie genoemd. Vervolgens wordt het afgekoeld tot ongeveer 55˚C. Het DNA
wordt nu blootgesteld aan hoge aantallen enkelstrengse primers. De primers hechten aan passende
stukken DNA, dit proces heet hybridisatie. Het DNA wordt daarna weer verhit tot 72˚C en in
aanwezigheid van de vrije stikstofbasen wordt een complementaire DNA-streng gevormd door taq-
polymerase, deze is bestendigd tegen hoge temperaturen en dus denatureert het niet. Het
nieuwgevormde dubbelstrengs DNA (dsDNA) wordt hierna opnieuw verhit. De twee strengen
denatureren vervolgens weer. Het hele proces kan zo herhaald worden, waarbij het aantal DNA-
strengen exponentieel toeneemt.
Hoge temperatuur verbreekt waterstofbruggen van de helix. Taq-polymerase uit bacterie gehaald
want bestand tegen hoge temperatuur.
