Hoorcollege 2: Western Blot
Westen blotting:
1. Een techniek om specifieke eiwitten in een complex mengsel van eiwitten m.b.v. elektroforese te scheiden en
immunologisch te detecteren.
- Scheiding op grootte (SDS-PAGE)
- Specifieke eiwit m.b.v. antilichamen
- M.b.v. een huishoudgen kan relatieve expressie van een eiwit worden berekend
Eiwitten worden gescheiden. Met behulp van specifieke antilichamen kun je iets specifieks wat je wilt aankleuren,
aankleuren. Dit kan dus gaan om CD3 of huishoudgen (zoals GAPDH), etc. met Western blotting.
Met 4 belangrijkste stappen:
1. Eiwitten scheiden
2. Eiwitten op membraan overbrengen (overblotten)
3. Aankleuren
4. Visualisatie (door vloeistof toe te voegen)
Stap 1: SDS-PAGE MBE
SDS: Sodium Docedyl Sulfaat
PAGE: Poly Acrylamide Gel Electroforese
SDS verbreekt tertiaire structuren en maakt de eiwitten lineair
(denaturatie). Bovendien zorgt het voor een negatieve lading. Hierdoor
kan het eiwit door d egel heen. Om de structuur van het eiwit te
veranderen, wordt er vaak een reducerende stof met vrij thiol groepen
(-SH groep) toegevoegd. Dit verbreekt de zwavelbruggen. Eiwit subunits
laten elkaar dan los.
Waarom niet meteen antilichaam op gel?
Niet mogelijk direct na elektroforese eiwitten te detecteren m.b.v. immunochemie
- Antilichaam diffunderen weg
- Gel vormt barrière voor antilichamen
De antilichamen kunnen niet naar waar ze op willen binden.
Eiwitten scheiden op grootte: grote eiwitten boven, kleine eiwitten onder.
Verschil met SDS-PAGE:
- SDS-PAGE: alle eiwitten kunnen worden aangetoond met een algemene kleuring, zoals Instan Blue of
Coommassie
- Na Western Blot wordt 1 specifiek eiwit aangetoond (afhankelijk van de antilichamen welk eiwit wordt
aangekleurd)
Stap 2: Overblotten (1)
Eiwit van de gel naar een PVDF-membraan overblotten.
- Sandwich maken
o Filter papier, gel, PBDF, filterpapier. Dit moet nat blijven! Dit wordt met 2 sponjes vastgeklemnd.
Geen luchtbellen! Dit zie je later weer terug.
PVDF-membraan: hele goede eiwit binder. Dus handschoenen aan. Marker is wel op het membraan zichtbaar, meet
eiwitten in de sample nog niet. Dit is een polymeermembraan, een soort plastic=eiwitaantrekker.
Stap 3: aankleuren. Dit is om je eiwit te visualiseren. Op het
membraan zit het eiwit wat je wilt visualiseren. Je voegt een
eerste antilichaam toe, gericht tegen dat eiwit. Tweede
antilichaam is gericht tegen de soort waar het eerste antilichaam
gemaakt is. Het tweede antilichaam moet kunnen binden aan
, het eerste antilichaam. Het tweede antilichaam heeft iets gekoppeld, waardoor het gevisualiseerd kan worden. Antilichaam
bindt aan het epitoop wat op het membraan zit.
Membraan eerst incuberen in blockbuffer voordat antilichamen worden toegevoegd (dit vermindert de aspecifieke
bindingen). De kans op aspecifieke bindingen wordt gereduceerd.
Wasstap: om de ongebonden antilichamen weg te spoelen.
Stap 4: visualisatie (1)
Meerdere manieren voor.
a. Colorimetrische methode:
- Als je aan de tag, of iets wat aan 2e antilichaam zit, een vloeistof toevoegt precipilaat vindt plaats meer
kleur, betekent meer eiwit aan je membraan. Robuust, maar je hebt veel eiwit nodig en is ongevoelig.
b. Fluorescentie methode:
- Antilichaam geeft verschillende kleuren fluorescentie af, die je zelf kunt toevoegen. Je kunt dus ook twee
eiwitten tegelijkertijd aantonen op zo een blot (rood/groen bijv).
c. Chemiluminescentie methode (meest gangbare methode):
- Chemische reactie laten plaatsvinden. Dat geeft een lichtje die je met de camera kunt opvangen. Het
vlaggetje wat eraan hangt (tijdens CIE), is HRP (horseradisch peroxidase). Tijdens CIE: tweede antilichaam is
gekoppeld aan HRP. Met behulp van toevoeging van een bepaalde kleurstof, kun je een bepaalde
luminescentie aflezen.
Stap 4: +ECL=visualisatie
Visualiseren door middel van toevoegen van ECL. Door toevoegen van ECL ontstaat het lichtje. Bij aanwezigheid peroxide,
katalyseert HRP de oxidatie van luminoi dat nu licht geeft.
Visualisatie
Ontwikkelen met ECL (chemiluminiscentie) is gebruikelijk (gevoeliger). Hiervoor heb je een donkere kamer nodig voor het
ontwikkelen van lichtgevoelige films of een speciale camera in een chemidoc system.
SDS-PAGE/Western Blotting, in tekst
1. Sample maken (bijv. cellysaat), denatureren van eiwitten (SDS, negatieve lading)
2. Opbrengen eiwitmengsel op polyacrylamide gel
3. Scheiden d.m.v. elektrisch veld (SDS-PAGE; eiwitten migreren van de negatieve naar de positieve pool, kleine
eiwitten migreren het snelst door de minste weerstand).
4. Blotten (overbrengen) van antigenen uit gel naar membraan
5. Detectie van specifiek eiwit m.b.v. antilichamen (zelfde principe als bij ELISA)
6. Visualisatie (licht, fluorescentie, etc.)
Tip: netjes werken en zorg ervoor dat de blot nooit droogvat!!
Als je netjes gewerkt hebt, maar bandjes zitten niet op de gewenst hoogte: kan bijvoorbeeld een ander eiwit zijn. Dus:
belangrijk om te weten waar je je bandjes verwacht.
Uitgelopen blot: kan komen doordat het secundaire antilichaam niet goed weggewassen is. Of doordat het secundaire
antilichaam aspecifiek is gaan binden. Controle zou dus kunnen zijn dat er alleen een tweede antilichaam wordt
meegenomen.
Voordelen/nadelen Western Blotting
Voordeel:
- M.b.v. huishoudgen relatieve expressie van een eiwit meetbaar.
- Meerdere eiwitten kunnen tegelijkertijd gedetecteerd worden
- De grootte van het eiwit kan bepaald worden
Nadeel: - Tijdrovende techniek, - Veel eiwit nodig, - Relatief hoge detectiegrens (niet heel gevoelig)
Hoorcollege 3 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Toepassingen ELISA
- Humane geneeskunde en diergeneeskunde
o Diagnostiek
o Therapie
Westen blotting:
1. Een techniek om specifieke eiwitten in een complex mengsel van eiwitten m.b.v. elektroforese te scheiden en
immunologisch te detecteren.
- Scheiding op grootte (SDS-PAGE)
- Specifieke eiwit m.b.v. antilichamen
- M.b.v. een huishoudgen kan relatieve expressie van een eiwit worden berekend
Eiwitten worden gescheiden. Met behulp van specifieke antilichamen kun je iets specifieks wat je wilt aankleuren,
aankleuren. Dit kan dus gaan om CD3 of huishoudgen (zoals GAPDH), etc. met Western blotting.
Met 4 belangrijkste stappen:
1. Eiwitten scheiden
2. Eiwitten op membraan overbrengen (overblotten)
3. Aankleuren
4. Visualisatie (door vloeistof toe te voegen)
Stap 1: SDS-PAGE MBE
SDS: Sodium Docedyl Sulfaat
PAGE: Poly Acrylamide Gel Electroforese
SDS verbreekt tertiaire structuren en maakt de eiwitten lineair
(denaturatie). Bovendien zorgt het voor een negatieve lading. Hierdoor
kan het eiwit door d egel heen. Om de structuur van het eiwit te
veranderen, wordt er vaak een reducerende stof met vrij thiol groepen
(-SH groep) toegevoegd. Dit verbreekt de zwavelbruggen. Eiwit subunits
laten elkaar dan los.
Waarom niet meteen antilichaam op gel?
Niet mogelijk direct na elektroforese eiwitten te detecteren m.b.v. immunochemie
- Antilichaam diffunderen weg
- Gel vormt barrière voor antilichamen
De antilichamen kunnen niet naar waar ze op willen binden.
Eiwitten scheiden op grootte: grote eiwitten boven, kleine eiwitten onder.
Verschil met SDS-PAGE:
- SDS-PAGE: alle eiwitten kunnen worden aangetoond met een algemene kleuring, zoals Instan Blue of
Coommassie
- Na Western Blot wordt 1 specifiek eiwit aangetoond (afhankelijk van de antilichamen welk eiwit wordt
aangekleurd)
Stap 2: Overblotten (1)
Eiwit van de gel naar een PVDF-membraan overblotten.
- Sandwich maken
o Filter papier, gel, PBDF, filterpapier. Dit moet nat blijven! Dit wordt met 2 sponjes vastgeklemnd.
Geen luchtbellen! Dit zie je later weer terug.
PVDF-membraan: hele goede eiwit binder. Dus handschoenen aan. Marker is wel op het membraan zichtbaar, meet
eiwitten in de sample nog niet. Dit is een polymeermembraan, een soort plastic=eiwitaantrekker.
Stap 3: aankleuren. Dit is om je eiwit te visualiseren. Op het
membraan zit het eiwit wat je wilt visualiseren. Je voegt een
eerste antilichaam toe, gericht tegen dat eiwit. Tweede
antilichaam is gericht tegen de soort waar het eerste antilichaam
gemaakt is. Het tweede antilichaam moet kunnen binden aan
, het eerste antilichaam. Het tweede antilichaam heeft iets gekoppeld, waardoor het gevisualiseerd kan worden. Antilichaam
bindt aan het epitoop wat op het membraan zit.
Membraan eerst incuberen in blockbuffer voordat antilichamen worden toegevoegd (dit vermindert de aspecifieke
bindingen). De kans op aspecifieke bindingen wordt gereduceerd.
Wasstap: om de ongebonden antilichamen weg te spoelen.
Stap 4: visualisatie (1)
Meerdere manieren voor.
a. Colorimetrische methode:
- Als je aan de tag, of iets wat aan 2e antilichaam zit, een vloeistof toevoegt precipilaat vindt plaats meer
kleur, betekent meer eiwit aan je membraan. Robuust, maar je hebt veel eiwit nodig en is ongevoelig.
b. Fluorescentie methode:
- Antilichaam geeft verschillende kleuren fluorescentie af, die je zelf kunt toevoegen. Je kunt dus ook twee
eiwitten tegelijkertijd aantonen op zo een blot (rood/groen bijv).
c. Chemiluminescentie methode (meest gangbare methode):
- Chemische reactie laten plaatsvinden. Dat geeft een lichtje die je met de camera kunt opvangen. Het
vlaggetje wat eraan hangt (tijdens CIE), is HRP (horseradisch peroxidase). Tijdens CIE: tweede antilichaam is
gekoppeld aan HRP. Met behulp van toevoeging van een bepaalde kleurstof, kun je een bepaalde
luminescentie aflezen.
Stap 4: +ECL=visualisatie
Visualiseren door middel van toevoegen van ECL. Door toevoegen van ECL ontstaat het lichtje. Bij aanwezigheid peroxide,
katalyseert HRP de oxidatie van luminoi dat nu licht geeft.
Visualisatie
Ontwikkelen met ECL (chemiluminiscentie) is gebruikelijk (gevoeliger). Hiervoor heb je een donkere kamer nodig voor het
ontwikkelen van lichtgevoelige films of een speciale camera in een chemidoc system.
SDS-PAGE/Western Blotting, in tekst
1. Sample maken (bijv. cellysaat), denatureren van eiwitten (SDS, negatieve lading)
2. Opbrengen eiwitmengsel op polyacrylamide gel
3. Scheiden d.m.v. elektrisch veld (SDS-PAGE; eiwitten migreren van de negatieve naar de positieve pool, kleine
eiwitten migreren het snelst door de minste weerstand).
4. Blotten (overbrengen) van antigenen uit gel naar membraan
5. Detectie van specifiek eiwit m.b.v. antilichamen (zelfde principe als bij ELISA)
6. Visualisatie (licht, fluorescentie, etc.)
Tip: netjes werken en zorg ervoor dat de blot nooit droogvat!!
Als je netjes gewerkt hebt, maar bandjes zitten niet op de gewenst hoogte: kan bijvoorbeeld een ander eiwit zijn. Dus:
belangrijk om te weten waar je je bandjes verwacht.
Uitgelopen blot: kan komen doordat het secundaire antilichaam niet goed weggewassen is. Of doordat het secundaire
antilichaam aspecifiek is gaan binden. Controle zou dus kunnen zijn dat er alleen een tweede antilichaam wordt
meegenomen.
Voordelen/nadelen Western Blotting
Voordeel:
- M.b.v. huishoudgen relatieve expressie van een eiwit meetbaar.
- Meerdere eiwitten kunnen tegelijkertijd gedetecteerd worden
- De grootte van het eiwit kan bepaald worden
Nadeel: - Tijdrovende techniek, - Veel eiwit nodig, - Relatief hoge detectiegrens (niet heel gevoelig)
Hoorcollege 3 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)
Toepassingen ELISA
- Humane geneeskunde en diergeneeskunde
o Diagnostiek
o Therapie
