Vraag 1 eukaryoot
Je krijgt de opdracht om een zebravis te maken die knock-out is voor het gen activating transcription
factor 3 (atf3). Dit doe je door met behulp van CRISPR-Cas9 een dubbelstrengs DNA breuk aan te
brengen in het atf3-gen. Hieronder staat het deel van het atf3-gen aangegeven waarin je de
dubbelstrengs breuk gaat aanbrengen:
5’CTCTC GCTTCATCCC AGGTAGTTCG GTGGGTCTCT CAGTGTTCAT GCAGGCTCTG
TCAGTGGTCA GGGTGCTCAT GCCGTTGGAC ATGCGTTTGT TCTGGATGGC GTAGCGCAGC
TCCTCTTTCA CTAATGGAGT GAAGTTTGTG AAGTCGTCCA GCGTGAGGGA ACCGGGCGGA
GAGAGACAGG GAACCAAAGC TGACGCACTG ATCTCTGACG GACCCAAACC AGGGTGCTGA
AGCATCATGC
a) Ontwerp op basis van bovenstaande sequentie het target-specifieke deel van het sgRNA dat je
gaat gebruiken om de dubbelstrengs breuk aan te brengen (5 punten).
Aan de volgende voorwaarden moet daarbij worden voldaan:
*Ga ervan uit dat dit target-specifieke deel van het sgRNA 20 nucleotiden lang moet zijn
*Ga ervan uit dat het sgRNA verderop in de procedure d.m.v. in vitro transcriptie gesynthetiseerd zal
worden vanaf een T7-promoter
*Geef de nucleotiden-sequentie van dit target-specifieke deel van het sgRNA van 5’ naar 3’ weer
*Onderstreep in bovenstaande sequentie van het Atf3 gen de locatie van het door jouw ontwikkelde
target-specifieke deel van het sgRNA
In vraag 1a) heb je het target-specifieke deel van het sgRNA ontworpen. Het volledige sgRNA bevat
naast dit target-specifieke deel ook nog een algemeen deel. De sequentie van dit algemene deel is als
volgt:
5’GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGG
CACCGAGUCGGUGCGGAUC
Het volledige sgRNA zal vervolgens gemaakt gaan worden door, met behulp van PCR, dubbelstrengs
DNA te maken waarin het sgRNA aan een T7-promoter gekoppeld is. Vervolgens wordt dit
dubbelstrengs DNA gebruikt om een in vitro transcriptie vanaf de T7-promoter uit te voeren waardoor
er sgRNA gesynthetiseerd wordt.
De sequentie en afleesoriëntatie voor de T7-promoter zijn als volgt:
5’GCGTAATACGACTCACTATA
b) Aan welke kant van het door jou ontworpen gen-specifieke deel van het sgRNA moet het algemene
deel van de sgRNA komen?
c) Aan welke kant van het sgRNA moet de T7 promoter komen?
Om de dubbelstrengs DNA breuk te maken in het Atf3-gen in de zebravis is naast het sgRNA ook het
Cas9 eiwit nodig. Hiervoor wordt Cas9 mRNA afgeschreven van het pCS2-nCas9n-plasmide waarop
het gen voor Cas9 ligt. Vervolgens wordt dit Cas9 mRNA samen met het sgRNA geïnjecteerd in
zebravis embryo’s.
Het Cas9-gen dat op het pCS2-nCas9n-plasmide ligt is codon-geoptimaliseerd voor zebravis.
Je krijgt de opdracht om een zebravis te maken die knock-out is voor het gen activating transcription
factor 3 (atf3). Dit doe je door met behulp van CRISPR-Cas9 een dubbelstrengs DNA breuk aan te
brengen in het atf3-gen. Hieronder staat het deel van het atf3-gen aangegeven waarin je de
dubbelstrengs breuk gaat aanbrengen:
5’CTCTC GCTTCATCCC AGGTAGTTCG GTGGGTCTCT CAGTGTTCAT GCAGGCTCTG
TCAGTGGTCA GGGTGCTCAT GCCGTTGGAC ATGCGTTTGT TCTGGATGGC GTAGCGCAGC
TCCTCTTTCA CTAATGGAGT GAAGTTTGTG AAGTCGTCCA GCGTGAGGGA ACCGGGCGGA
GAGAGACAGG GAACCAAAGC TGACGCACTG ATCTCTGACG GACCCAAACC AGGGTGCTGA
AGCATCATGC
a) Ontwerp op basis van bovenstaande sequentie het target-specifieke deel van het sgRNA dat je
gaat gebruiken om de dubbelstrengs breuk aan te brengen (5 punten).
Aan de volgende voorwaarden moet daarbij worden voldaan:
*Ga ervan uit dat dit target-specifieke deel van het sgRNA 20 nucleotiden lang moet zijn
*Ga ervan uit dat het sgRNA verderop in de procedure d.m.v. in vitro transcriptie gesynthetiseerd zal
worden vanaf een T7-promoter
*Geef de nucleotiden-sequentie van dit target-specifieke deel van het sgRNA van 5’ naar 3’ weer
*Onderstreep in bovenstaande sequentie van het Atf3 gen de locatie van het door jouw ontwikkelde
target-specifieke deel van het sgRNA
In vraag 1a) heb je het target-specifieke deel van het sgRNA ontworpen. Het volledige sgRNA bevat
naast dit target-specifieke deel ook nog een algemeen deel. De sequentie van dit algemene deel is als
volgt:
5’GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGG
CACCGAGUCGGUGCGGAUC
Het volledige sgRNA zal vervolgens gemaakt gaan worden door, met behulp van PCR, dubbelstrengs
DNA te maken waarin het sgRNA aan een T7-promoter gekoppeld is. Vervolgens wordt dit
dubbelstrengs DNA gebruikt om een in vitro transcriptie vanaf de T7-promoter uit te voeren waardoor
er sgRNA gesynthetiseerd wordt.
De sequentie en afleesoriëntatie voor de T7-promoter zijn als volgt:
5’GCGTAATACGACTCACTATA
b) Aan welke kant van het door jou ontworpen gen-specifieke deel van het sgRNA moet het algemene
deel van de sgRNA komen?
c) Aan welke kant van het sgRNA moet de T7 promoter komen?
Om de dubbelstrengs DNA breuk te maken in het Atf3-gen in de zebravis is naast het sgRNA ook het
Cas9 eiwit nodig. Hiervoor wordt Cas9 mRNA afgeschreven van het pCS2-nCas9n-plasmide waarop
het gen voor Cas9 ligt. Vervolgens wordt dit Cas9 mRNA samen met het sgRNA geïnjecteerd in
zebravis embryo’s.
Het Cas9-gen dat op het pCS2-nCas9n-plasmide ligt is codon-geoptimaliseerd voor zebravis.
