samenvatting - eiwittechnologie - UCLL(biochemie)

Eiwittechnologie
H1: Buffers
1.1 belang van buffers
intracellulaire processen:
⁃ pH wordt nauw gereguleerd om enzymatische activiteiten en metabolische
processen te ondersteunen: bv. Pepsine werkt optimaal bij lage pH

natuurlijke buffers: fosfaat, bicarbonaat en proteïnen (Z of B AZ-residuen) helpen pH in
biologische vloeistoffen te stabiliseren

[base ]
Henderson-Hasselbalch: pH = pKa + log
[ zuur ]
⁃ om pH van bufferoplossingen te voorspellen (enkel geldig in verdunde
oplossingen)

1.2 buffercapaciteit (β)
de hoeveelheid sterk Z of B nodig om de pH met één eenheid te veranderen
⁃ β is maximaal bij pH = pKa
⁃ buffers zijn effectief bij pH = pKa ± 1
⁃ bij verdunning van buffer ↓ β

1.3 pKa en externe factoren
invloed van ionische sterkte op pKa: Debye-Hückel-vergelijking (bij 25°C)
⁃ hier is n afhankelijk v/d lading van het Z of B
(n = 2z – 1 met z = lading v/d zure vorm v/d buffer)
o n > 0  pKa daalt bij verdunning
o n < 0  pKa stijgt bij verdunning
⁃ verdunning verlaagt de ionische sterkte en kan de pKa doen stijgen of dalen

invloed van T op pKa: Van ’t Hoff-relatie
⁃ T ↑ ,meer zuurdissociatie, grotere Ka, kleinere pKa
⁃ Buffers als fosfaat (pKa 7,2) hebben kleine T-afhankelijkheid: -0,0028 pKa/°C
⁃ Tris (pKa 8,08) is gevoeliger: -0,028 pKa/°C

Samengevat: pH is afhankelijk van pKa, en die is op zijn beurt afhankelijk van verdunning
en ∆T
 Stel buffers in op dezelfde temperatuur als dat je hem gaat gebruiken
 Bij het bereiden v/e buffer vanaf een stockoplossing moet je rekening houden met
dat het verdunnen v/e buffer de pH kan wijzigen

1.4 criteria voor buffers in biologisch onderzoek
⁃ Effectief in het gewenste pH-bereik: voldoende buffercapaciteit (pKa ± 1)
⁃ Stabiel zijn: Resistent tegen hydrolyse en enzymatische afbraak
⁃ Niet-toxisch: Essentieel voor celkweek en enzymatische reacties
⁃ Lage absorptie in UV/zichtbaar licht: Cruciaal voor spectrofotometrische
analyses
⁃ Geen interferentie: Buffers als fosfaat en Tris kunnen ongewenste interacties
aangaan met enzymen of ionen

,1.5 praktische bereiding van buffers




1.6 klassieke buffers
Tris-buffer (Tris-HCl): trihydroxymethylaminomethaan
⁃ Hoge β, lage toxiciteit, lage interferentiegraad en
beschikbaarheid in zuivere vorm
⁃ pKa 8,06  buffert optimaal tussen pH 7,5 en 8,5
⁃ Nadelen: sterke T-afhankelijkheid, reageert met metalen als Cu 2+, Ni2+ en Ca2+

Boraatbuffer en glycine buffers: TBE
⁃ Lage UV-absorbantie en tolereren divalente ionen
⁃ boraat pKa 9,23 en glycine pKa 9,78  domein tussen pH 8,7 en 9,7
⁃ boraat is toxisch en heeft een maximale oplosbaarheid van 0,2 M
⁃ glycine heeft 2 buffergebieden




Carbonaatbuffer:
⁃ domein van pH 10 tot 10,8 maar gevoelig voor CO2-verlies en
metaalprecipitatie
⁃ gebruik onder constante CO2-atmosfeer




Fosfaatbuffer:

⁃ beperkt in toepassing vanwege binding aan Ca2+ en Mg2+, toxische effecten op
eukaryote cellen
⁃ goede β
⁃ PBS (phosphate bufferd saline) meest gebruikte buffer
in biologische systemen

,Formaat-acetaat buffer: TAE
⁃ Nuttig in lager pH gebied (3 – 4,5)
⁃ Gebruikt voor chromatografie en elektroforese



EDTA: Ethyleendiaminetetraacetaat
⁃ pH domein tussen 6 en 7
⁃ om magnesium en calcium te cheleren
⁃ ionen vermijden en nucleasen inactiveren
⁃ gebruikt in lage c (0,001 M) in optische studies
omdat het UV-licht absorbeert



Glycylglycine en triethanolamine buffers
⁃ reageren niet met magnesium- en calcciumionen
⁃ geen UV-absorptie en verdraagt de meeste enzymen
⁃ nadeel: glycylglycine wordt door sommige proteasen afgebroken
⁃ triethylanolamine is vluchtig en kan gebruikt worden wanneer de buffer achteraf
verwijderd moet worden

1.7 goodbuffers
ontwikkeld door Norman Good (1966):
⁃ speciaal ontworpen om nadelen van klassieke buffers te vermijden
o stabiel over concentratie- en T-bereik
o geen absorptie van UV-licht
o zwitterionische structuur voorkomt celinterferentie
o resistent tegen hydrolyse en enzymatische activiteit
⁃ voorbeelden: HEPES, Tricine, TES, MOPS
⁃ nadelen: hogere kosten

, H2: Detergenten
2

2.1 Definitie van detergenten
Amfifatische moleculen: zowel hydrofiele kop als hydrofiele staart
 Vormen micellen in water: gestructureerde clusters van detergentmoleculen
 Detergenten kunnen hydrofobe moleculen zoals lipiden oplossen in waterige
omgevingen

2.2 Polariteit:
Polair: molecuul of groep met ongelijke ladingverdeling. Bv: water, alcoholen, suikers
⁃ Hydrofiel: lost goed op in water
⁃ Lipofoboob: stoot vet af

Apolair: ladingsverdeling is gelijk. Bv: vetten, olie, benzine
⁃ Hydrofoob: stoot water af
⁃ Lipofiel: lost goed op in vet

2.3 Biologische membranen
Bestaan voornamelijk uit:
⁃ Fosfoglyceriden (40 – 50 %)
⁃ Eiwitten (50 – 60 %)

Fosofolipiden in lipidendubbellaagstructuur gehouden door niet-covalente interacties
⁃ stabilisatie door hydrofobe interacties en Van der Waals-krachten
⁃ ook elektrostatische interacties en H-bruggen zorgen voor stabiliteit

Detergenten kunnen:
⁃ dubbellaag destabiliseren door interactie met lipiden en eiwitten
⁃ membraaneiwitten isoleren

2.4 Classificatie van detergenten

2.4.1 Ionische Detergenten
⁃ Eigenschappen: Bevatten geladen kopgroepen (positief of negatief)
⁃ Voorbeelden:
o SDS (Sodium Dodecyl Sulfate): Anionisch, bevat negatief geladen
sulfaatgroep
o CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide): Kationisch, bevat
positief geladen trimethylammoniumgroep
⁃ Toepassing: denatureren van eiwitten en het volledig oplossen van
membranen

2.4.2 Galzuren
⁃ Eigenschappen: Anionische detergenten met een rigide sterol hydrofobe
groep, deze moleculen hebben geen duidelijke polaire kopgroep maar
een polaire en een apolaire kant
 bv: natriumdeoxycholaat.
⁃ Micelstructuur: Vormt niervormige in plaats van bolvormige micellen.
⁃ Beperkingen: Werkt enkel in alkalische omstandigheden, tenzij
geconjugeerd (lagere pKa-waarde)