Samenvatting Oncogenetica - toekomst van oncogenetisch onderzoek

Oncogenetica – toekomst van
oncogenetische research (Prof. Dr. Op de
Beeck)
1. Inleiding
Hoe ontstaat kanker?
 Somatische mutatie theorie  kanker ontstaat niet door mutatie van 1
gen, meestal verschillende genen in 1 pathway of in verschillende
pathways aangestats
o GOF: oncogenen
o LOF: tumor suppressor genen
 Epigenetische veranderingen
 Genomische instabiliteit
 Probleem: analyse huidige dataset  weinig therapeutische targets
o Oplossing: meer sequencen?
o Waarom sequencen?
 Kanker ontstaat niet door alteratie in 1 gen
 Mutaties ontstaan door
 Blootstelling genotoxische agentia
 Fouten in DNA replicatie
 Snel delende cellen: hoger risico
 Tijdens embryogenese: celdelingen
 Toch is kanker meestal een ouderdomsziekte
 Fouten in DNA replicatie

Darm
 90% klinische tumoren  epitheel (snel delend)
 10.000.000 cryptes/colon: onderhouden door stamcellen
 Elke stamcel deelt 1/dag
 Over 70 jaar: 2,6 mutaties/100.000 nt
 CRC genoom: 1 mutatie/100.00 nt

Klinische tumoren hebben +/- 100 niet-sporadische mutaties
 20% driver = in verschillende patiënten vinden ze het terug  hot spot
mutaties
 80% passenger = toegenomen genomische instabiliteit

Tumor heterogeniteit
 Binnen de tumor is er genetische selectie
 Tumor behandelen  behandeling blijven geven  patienten worden
resistent  maar toch initieel een mooie respons
o Bepaalde regio’s in tumor die andere mutaties bevatten dan andere
regio’s  tumor is geen homogene massa
 Renaal celcarcinoom  metastase in borstwand en long
o Tumor in verschillende regio’s onderverdeeld  DNA extraheren van
de verschillende regio’s en sequencen
 De verschillende regio’s zijn genetisch verschillend
 Regio’s die ver van elkaar liggen (fylogenetische boom)
 Mutaties in primaire tumor en mutaties van metastase zijn
toch verschillend

1

,  Binnen de pirmaire tumor heb je dat ook
 Hoe dichter regio’s bij elkaar liggen  hoe homogener ze zijn
o  Bepaalde regio’s die mutaties bevatten die regio’s resistent
maken tegen therapie dan gaan die blijven groeien
o Highthrougput technieken zijn nodig!
 Als we gewoon biopt nemen met fijne naald uit tumor dan heb je maar een
kleine regio uit de tumor  dat sequencen  patient resistent ja of nee
maar dat zegt niets over de andere stukken


1.1. Nieuwe therapeutische targets
Zoektocht naar nieuwe therapeutische targets = moeizaam
 Moeilijkeheden
o Tumor heterogeniteit
o Omics-datasets niet onafhankelijk van elkaar
 Geïntegreerde analysen noodzakelijk  info nodig van verschillende zaken
niet alleen van genoom maar ook van methyloom, transxcriptoom en zelfs
proteinen
o Door combinatie te doen begint er wel het één en ander op gang te
komen
o Veel bioinformatica want veel data
o Interactie tussen genetica/epigenetica


2. Technieken
2.1. Next generation sequencing
Next generation sequencing (NGS) is een van de meest voor de hand liggende te
gebruiken methode, waarbij een deel van het genoom (een DNA sequentie)
uitgelezen wordt base per base waardoor we de DNA code kunnen bepalen van
een gen en daarmee verschillende expressie- en methylatie patronen kunnen
vaststellen.


2.2. Micro-array
2.2.1.SNP
We kunnen ook gebruik maken van een micro-array die SNP’s opspeurt. Bij een SNP array willen we
gaan kijken naar de mate van chromosomale instabiliteit. Indien een genoom instabiel is zullen
stukken DNA van de chromosomen loskomen en binden aan andere chromosomen, wat leid tot een
aberrante fusie, wat we kunnen detecteren. Men hebbe het genomisch DNA van een tumorcel, wat
eerst zal worden geamplificeerd. Hierna zal dit gerepliceerde DNA worden gefragmenteerd en deze
kleine delen DNA zullen onderzocht worden op het voorkomen van SNP’s op bepaalde locaties. Om
dit te kunnen doen zal het DNA gehecht worden op een bead- chip. Deze bevat kleine gaatjes met
beads erin, waarop oligonucleotiden gehecht zitten. Deze oligo’s zijn zo ontwikkeld dat bij hechting
van ons gefragmenteerde DNA, de te onderzoeken SNP zich aan het einde van de oligo zal gaan
bevinden. Vervolgens voeren we een single-base-extension uit waarmee de nucleotide sequentie
van de SNP kan worden vastgesteld aan de hand van een signaal gecreëerd door laser-excitatie van
een fluorochroom.




2

,  2 verschillende soorten info
o SNP array hier van gezonde persoon  2 grafieken met verschillende kolommen (1-
22 = chromosomen)  op begin breed en op einde smaller  representeert de
lengte van de chromosomen
o Al de stipjes zijn de SNP’s die op de array zitten en waar je info van hebt gekrijgen
o LogR: de log van de ratio  welke ratio  intensiteitssignaal  hoe intens is een
puntje
 Genomisch instab tumor  stipjes (SNP’s) gaan intenser zijn want je hebt
meer materiaal van vb chromosoom 1
 Staal van interesse vergelijken tov staal waar je van weet dat het diploid is
(gezond dus)  zlfde signaal  dan krijg je lijn die zich rondom 0 beweegt
 gen verschil tussen staal en gezond persoon dus doploid staal
o BAF: heeft te maken met genotype data
 B allel frequentie (BAF)  SNP genotyperen kan dat ofwel A allel hebben
ofwel B allel  elke SNP is anders
 Over chromosoom zijn er stukken die heterozygoot zijn  B allel
frequentie  dus zowel B als A allel want 2 verschillende genen
o Alle SNP’s die zowel B als A allel hebben gevinden zich rond
0,5
 Homozygote SNP’s  enlkel B allel  BAF is dan 100% (1)
o Enkel A allel  0

Alle puntjes die we zien op de resultaten van de SNP-array is informatie verkregen van een SNP
verspreid over de verschillende chromosomen (kolommen). In geval van de LogR verwachten we bij
gezonde stalen dat de distributie van de puntjes gelegen zal zijn rondom de 0.

De BAF-curve (b-allel frequentie curve) toont het genotype verkregen uit de array. Een SNP kan
maar 2 allelen hebben, A en B. De BAF-curve toont ons het ratio tussen de A en B allel. Als het B-allel
1 is betekent dat voor die SNP alleen de B-allel is waargenomen en er dus een verlies is van het A-
allel (loss of heterozygosity). Voor sommige SNP’s zal er heterozygositeit optreden, waarbij we dus
een band perfect in het midden zien rond de 0.5. Dit laatste is wat we verwachten van een gezond
staal.

3

,  Beeld van een tumor
 Lijn loopt golvend  = chromosomaal instabiele tumor  op relatief
goedkope manier heb je dit kunnen ontdekken
 2 complementair
 Afwijkingen in B allel frequentie
o Chromosoom 1: geen heterzogyte meer alleen homozygote = loss
of heterozygosity
 2 chromosomen die identiek zijn aan elkaar  dan heb je
uiteraard alleen homozygote
 Ofwel maar 1 chromozoom dan is alles homozygoot
 Verlies van maternaal/paternaal allel in een tumor
o Chromosoom 2: 4 lijnen (ipv 3 lijnen)  copy number alteratie 
niet meer 2 kopien maar 3 kopien
 Kan copy number neutraal zijn (UPD)
 Dit zou je in toekomst ook kunnen doen met NGS
o Is wel duurder hoewel prijs is aan het dalen
o Veel minder reads nodig om ong dezelfde analyse dan dit te doen 
low pass sequencing  niet 30x maar 0,1x
 Copy number variatie  onbalans
 Niet veel info nodig

2.2.2.Methylatie
 Kijken naar methylatie
 Densiteit van beads zijn nu al wel verdubbeld  dus dubbel zoveel kunnen
doen

2.2.3.Gen expressie
 Verschillende oligonucleotiden waarvan sequentie overeenkomt met mRNA
 Hoe meer RNA  heo meer er aan probe gaat binden
 Detectie doordat RNA is gelabeld (fluorescent) en dan door intensiteit 
hoe meer mRNA er gebonden is aan probe hoe meer intensiteit
 Nadeel van dit systeem = enkel kijken naar mRNA die op die beads zitten
 alles wat daar niet op zit kan je niet bekijken
o Tegenwoordig kan je dat counteren  RNA sequencing gebeurt door
NGS apparaat en daar kan je hypothese vrij kijken  daar kan je
naar alles kijken
 Wel duurder
 Moeilijker te analyseren

4