H6 RNA-technieken
1. RNA-isolatie
Aangezien RNA makkelijk hydrolyse ondergaat door NaOH of RNase H is
het belangrijk om RNase-vrij te werken.
o RNasen wordt niet geïnactiveerd door autoclaveren, maar wel door
behandeling van waterige oplossingen met DEPC gedurende 2u bij
37°C
o DEPC reageert met het katalytisch histidine in het reactief centrum
van RNase en zorgt zo voor inhibitie van de enzymatische activiteit
o Glas en metaal wordt RNase-vrij gemaakt door 2u bakken bij 180°C
o RNA-manipulatie gebeurt steeds met handschoenen en filtertips
o RNA moet tijdens de manipulatie steeds op ijs gehouden worden
Na het openbreken van cellen en weefsels wordt de celmembraan
gelyseerd met een mild detergent (vb. NP40) en het RNA gescheiden
van de rest van de celinhoud
Het totaal RNA-extract bestaat voor 95% uit rRNA en slechts 5% uit
mRNA
Verdere opzuivering van het RNA kan gebeuren door zure fenol-
chloroform extractie, ethanolprecipitatie of kolomchromatografie
o Bij zure fenol-chloroform extractie worden de eiwitten gedenatureerd
met behulp van guanidine thiocyanaat en worden de DNA-, RNA- en
eiwitfasen van elkaar gescheiden door centrifugatie. RNA bevindt
zich dan in de bovenstaande waterige fase, de eiwitten in de
onderste organische fase en
DNA er tussenin.
o Bij size exclusion kolomchromatografie wordt het RNA-extract
verrijkt voor mRNA door selectieve binding van RNA ≥ 200
nucleotiden op een silicamatrix (rRNA, tRNA en lncRNA worden dus
uitgesloten)
o Bij affiniteitskolomchromatografie wordt selectief mRNA met een
polyA-staart gebonden aan een oligo(dT) cellulose- of poly(U)
sepharose-matrix
Bewaring van RNA gebeurt steeds bij -20 °C of voor langere tijd bij -80
°C. Vries-dooi cycli worden zo veel mogelijk vermeden door kleine
aliquots in te vriezen.
De concentratie van RNA wordt bepaald met behulp van de wet van
Lambert-Beer (A=C.e.l) door de absorbantie te meten bij 260 nm. Voor
enkelstrengig RNA is de extinctiecoëfficiënt e = 0,025 (μg/ml)/cm, dus
bij l=1 cm is C = A260 . 40
De zuiverheid van RNA wordt bepaald door aanwezig aromatische
aminozuren te bepalen bij A280 en contaminerende organische
1
, verbindingen en chaotrope zouten bij A230. De verhouding A260/A280 is
optimaal bij 1,7-2,0 en de verhouding A260/A230 best groter dan 1,5
De kwaliteit, en dan vooral de afbraak van RNA kan nagegaan worden
met behulp van agarose elektroforese. Scherpe 18S en 28S ribosomale
banden hierbij duiden op intact RNA, terwijl een
smeer van afgebroken 18S en 28S rRNA
aantonen dat het RNA is afgebroken. Ook met
een Bioanalyzer kan je aan de hand
van capillaire elektroforese in een chip de
afbraak van RNA bepalen. In het bekomen
elektroferogram verwachten we
voor intact RNA scherpe pieken voor het
ribosomaal RNA met de piek van 18S kleiner
dan die van 28S en een RIN-factor (RNA
integrity number) van 10.
2. cDNA synthese
Voor de amplificatie van mRNA, moet het matuur mRNA eerst omgezet
worden tot cDNA (complementair DNA) zonder introns.
De 5’ naar 3’ synthese van cDNA op basis van mRNA gebeurt door het
enzym reverse transcriptase (RT) afkomstig uit retrovirussen (AMV,
MMLV) en primers. De primers die hiervoor kunnen dienen zijn oligo(dT)
primers, anchored oligo(dT) primers, random hexameren of
genspecifieke primers
o Annealing primers: 5 min bij 25°C
o 5'-3' synthese van DNA door RT en afbraak mRNA door Rnase H: 20
min bij 46°C
o RT inactivatie: 1 min 95°C
De vorming van de tweede cDNA streng gebeurt door DNA
3. Amplificatie van cDNA
Initiële denaturatiestap: 2-5 min bij 95°C
o Denaturatie van de cDNA duplex: 10-20 sec bij 92 °C tot 95°C
o Annealing van genspecifieke primers: 20-40 sec bij Tm - 5°C
o Elongatie van de primers aan hun 3' uiteinde: 20-40 sec bij 72°C (1
min/kb)
Finale elongatiestap: 1-3 min bij 72°C
4. Eénstapsreactie: cDNA synthese + amplificatie
RT-synthese: 30 min bij 50-60°C
Inactivatie RT + activatie Hotstart Taq polymerase + denaturatie cDNA:
15 min bij 95°C
2
1. RNA-isolatie
Aangezien RNA makkelijk hydrolyse ondergaat door NaOH of RNase H is
het belangrijk om RNase-vrij te werken.
o RNasen wordt niet geïnactiveerd door autoclaveren, maar wel door
behandeling van waterige oplossingen met DEPC gedurende 2u bij
37°C
o DEPC reageert met het katalytisch histidine in het reactief centrum
van RNase en zorgt zo voor inhibitie van de enzymatische activiteit
o Glas en metaal wordt RNase-vrij gemaakt door 2u bakken bij 180°C
o RNA-manipulatie gebeurt steeds met handschoenen en filtertips
o RNA moet tijdens de manipulatie steeds op ijs gehouden worden
Na het openbreken van cellen en weefsels wordt de celmembraan
gelyseerd met een mild detergent (vb. NP40) en het RNA gescheiden
van de rest van de celinhoud
Het totaal RNA-extract bestaat voor 95% uit rRNA en slechts 5% uit
mRNA
Verdere opzuivering van het RNA kan gebeuren door zure fenol-
chloroform extractie, ethanolprecipitatie of kolomchromatografie
o Bij zure fenol-chloroform extractie worden de eiwitten gedenatureerd
met behulp van guanidine thiocyanaat en worden de DNA-, RNA- en
eiwitfasen van elkaar gescheiden door centrifugatie. RNA bevindt
zich dan in de bovenstaande waterige fase, de eiwitten in de
onderste organische fase en
DNA er tussenin.
o Bij size exclusion kolomchromatografie wordt het RNA-extract
verrijkt voor mRNA door selectieve binding van RNA ≥ 200
nucleotiden op een silicamatrix (rRNA, tRNA en lncRNA worden dus
uitgesloten)
o Bij affiniteitskolomchromatografie wordt selectief mRNA met een
polyA-staart gebonden aan een oligo(dT) cellulose- of poly(U)
sepharose-matrix
Bewaring van RNA gebeurt steeds bij -20 °C of voor langere tijd bij -80
°C. Vries-dooi cycli worden zo veel mogelijk vermeden door kleine
aliquots in te vriezen.
De concentratie van RNA wordt bepaald met behulp van de wet van
Lambert-Beer (A=C.e.l) door de absorbantie te meten bij 260 nm. Voor
enkelstrengig RNA is de extinctiecoëfficiënt e = 0,025 (μg/ml)/cm, dus
bij l=1 cm is C = A260 . 40
De zuiverheid van RNA wordt bepaald door aanwezig aromatische
aminozuren te bepalen bij A280 en contaminerende organische
1
, verbindingen en chaotrope zouten bij A230. De verhouding A260/A280 is
optimaal bij 1,7-2,0 en de verhouding A260/A230 best groter dan 1,5
De kwaliteit, en dan vooral de afbraak van RNA kan nagegaan worden
met behulp van agarose elektroforese. Scherpe 18S en 28S ribosomale
banden hierbij duiden op intact RNA, terwijl een
smeer van afgebroken 18S en 28S rRNA
aantonen dat het RNA is afgebroken. Ook met
een Bioanalyzer kan je aan de hand
van capillaire elektroforese in een chip de
afbraak van RNA bepalen. In het bekomen
elektroferogram verwachten we
voor intact RNA scherpe pieken voor het
ribosomaal RNA met de piek van 18S kleiner
dan die van 28S en een RIN-factor (RNA
integrity number) van 10.
2. cDNA synthese
Voor de amplificatie van mRNA, moet het matuur mRNA eerst omgezet
worden tot cDNA (complementair DNA) zonder introns.
De 5’ naar 3’ synthese van cDNA op basis van mRNA gebeurt door het
enzym reverse transcriptase (RT) afkomstig uit retrovirussen (AMV,
MMLV) en primers. De primers die hiervoor kunnen dienen zijn oligo(dT)
primers, anchored oligo(dT) primers, random hexameren of
genspecifieke primers
o Annealing primers: 5 min bij 25°C
o 5'-3' synthese van DNA door RT en afbraak mRNA door Rnase H: 20
min bij 46°C
o RT inactivatie: 1 min 95°C
De vorming van de tweede cDNA streng gebeurt door DNA
3. Amplificatie van cDNA
Initiële denaturatiestap: 2-5 min bij 95°C
o Denaturatie van de cDNA duplex: 10-20 sec bij 92 °C tot 95°C
o Annealing van genspecifieke primers: 20-40 sec bij Tm - 5°C
o Elongatie van de primers aan hun 3' uiteinde: 20-40 sec bij 72°C (1
min/kb)
Finale elongatiestap: 1-3 min bij 72°C
4. Eénstapsreactie: cDNA synthese + amplificatie
RT-synthese: 30 min bij 50-60°C
Inactivatie RT + activatie Hotstart Taq polymerase + denaturatie cDNA:
15 min bij 95°C
2
