DTM: Klinische biologie
Inleiding =
Klinische biologie = labo-geneeskunde --> = labo testen op lichaamsvochten + prelevementen =
- Bloed + serum
- Urine + faeces
- Cerebrospinaal vocht
---> doel van onderzoeken =
• Ziekte diagnosticeren
• Balans opmaken vd werking v orgaan
• Effect v behandeling beoordelen
---> 3 grote pijlers v klinische biologie =
- Klinische chemie
- Hematologie
- Microbiologie
---> 3 fases v klinische biologie =
1. Pre-analytische biologie =
▪ Aanvraag staalafname ---> = medische context moet geschetst zijn
▪ Staalafname zelf
▪ Transport nr labo
▪ Voorbehandeling v stalen
---> er bestaan aanvraagsets op maat ---> bv. op intensieve = altijd zelfde parameters
aanvragen = set ontwikkelen die in 1 keer kan worden aangeduid
---> Klinisch arts mag ook testen schrappen/toevoegen
2. Analytische fase
3. Post-analytische fase
= 2 soorten validaties voor testen =
▪ Technische validatie = kijken of test functioneel goed verlopen is en of
resultaat mogelijk is bij dat soort testen
▪ Klinische validatie = resultaat vgl met andere resultaten v patiënt = in
medische context kijken ---> vermoedelijke diagnose stellen
---> hier ook resultaten rapporteren + eventueel deelname aan multidisciplinair overleg
1/3e van de testen die dr huisartsen worden aangevraagd = overbodig = kost veel geld
1
,Analytische technieken =
1. Fotometrie
= gebaseerd op wet v Lambert-beer --->
---> door reactie = ontstaan of verdwijnen v gekleurde
component in meetcurve = absorberen v kleur/licht
---> Hoeveelheid geabsorbeerd licht = evenredig met aanwezige concentratie van:
- Meeste substraten = bv. glucose + creatinine + Ca + Fe + …
- Alle enzymen
---> testen gebeuren met minimaal verbruik v monster + materiaal
Werking =
Absorbantie bepalen =
Negatieve logaritme nemen v transmissie v licht
---> = verhouding v
- Teller = licht dat gepasseerd is dr cuvet
- Noemer = aantal licht voor passage
---> ook altijd blanco meten = de cuvet zal sws wat
licht absorberen
Biureet reactie =
Eiwit concentratie meten in oplossing ---> = koper complex maken (Cu2+) = heeft paarse kleur
---> intensiteit v kleur = rechtevenredig met hoeveelheid peptidebindingen = hoeveelheid eiwit
---> zo uiteindelijk een standaardcurve uitzetten voor totaal aantal eiwitten =
▪ Y-as = absorbatie bij 540 nm
▪ X-as = eiwitconcentratie
2. Potentiometrie
= elekrochemische methode ---> gebaseerd op wet v Nernst --> = voor metingen v elektrolyten =
- Directe potentiometrie = meting op onverdund staal
- Indirecte potentiometrie = meting op verdund staal
---> = belangrijk want: als persoon aandoening heeft dat componenten v bloed laat
toenemen (bv. hyperlipemie) = elektrolyen in bloed sws verdunnen
---> dus stel indirecte meting uitvoeren = nog meer verdunnen = kan vertekent resultaat
geven
2
,3. Elektroforese
= macromoleculen scheiden obv nettolading oiv elektrisch veld --->
- Kan op gel = gelelektroforese
- In capillair = capillaire elektroforese
---> door verschillende ladingen + vormen = sneller/tragen migreren = onderscheid maken
Soorten elektroforese =
- Eiwitelektroforese = scheiden v eiwitten in serum + urine + CSV ---> = belangrijk bij
diagnostiek v myeloom
- Hb-elektroforese = onderzoek v lysaat v RBC ter detectie v Hb-mutanten =
• HbS bij sikkelcelanemie
• HbA2 bij thalassemie
4. Immunologische assays =
---> 2 belangrijke componenten =
- = Polyklonale of monoklonale antilichamen gebruiken als reagens ---> antigen
detecteren =
• Polyklonaal = allemaal verschillende specificiteit voor pathogeen
• Monoklonaal = allemaal zelfde specificiteit = tegen zelfde epitoop
- Antigen gebruiken om antilichaam v belang te detecteren
---> bepaling v antigen of antilichaam in vitro = enkel mogelijk als antigen-antilichaam binding
zichtbaar kan worden gemaakt =
- Immunoturbidimetrie = immunofelometrie = voor detectie v eiwitten ---> werking =
1. Toevoegen antilichaam
2. Binden aan antigen
3. Fijne nevel ontstaan
4. Immuuncomplexen hierin meten
- Radio-immuno assay (RIA) =
Antigenen in zeer lage concentraties meten ---> competitieve binding ts:
• Radio-actief gelabeld antigeen
• Onbekende antigeen in monster
- Vervangen dr koude alternatieven =
• ELISA = enzyme linked immunosorbent assay
• ECLIA = elektrochemiluniscentie immunoassay
3
, Werkingsprincipe ELISA =
- Directe ELISA =
1. Target proteïne = vasthouden op bodem v
detectieplaats
2. Antilichamen toevoegen tegen antigen = eiwit v
interesse
---> antilichamen = gelabeld met enzymes
3. Niet gebonden antilichamen wegwassen
4. Substraat toevoegen
5. Substraat interageert met enzyme =
kleurreactie ontstaan
---> intensiteit v kleurreactie = maat voor concentratie v
het antigen
- Indirecte ELISA =
= specifiek antilichaam detecteren ---> = gebruik maken v antigenen tg antilichaam =
1. Antigenen inbrengen
2. Monster toevoegen = bevat antilichamen ---> binden aan antigenen
3. Wassen
4. Enzym-gelabeld secundiar antilichaam toevoegen = binden aan primair
antilichaam v patiën
5. Substraat toevoegen = kleurverandering
- Sandwich ELISA =
= Niet beginnen met target eiwit te capteren --->
1. Eerst gebruik maken v wellen die gecoat zijn met antilichamen
2. Antigen v interesse in serum v patiënt = toevoegen
3. Antigen laten binden aan antilichamen
4. Enzym-gelabeld antilichaam toevoegen ---> = bindt aan antilichamen
waaraan target eiwit gebonden is
5. Wassen
6. Substraat toevoegen ---> kleurverandering
Algemene doel ELISA = specifieke antigeen-antilichaamreacties zichtbaar maken en
kwantificeren via kleurreactie
Meten van:
Antigen Antilichaam
- Sandwich ELISA - Indirecte ELISA
- Directe ELISA
4
Inleiding =
Klinische biologie = labo-geneeskunde --> = labo testen op lichaamsvochten + prelevementen =
- Bloed + serum
- Urine + faeces
- Cerebrospinaal vocht
---> doel van onderzoeken =
• Ziekte diagnosticeren
• Balans opmaken vd werking v orgaan
• Effect v behandeling beoordelen
---> 3 grote pijlers v klinische biologie =
- Klinische chemie
- Hematologie
- Microbiologie
---> 3 fases v klinische biologie =
1. Pre-analytische biologie =
▪ Aanvraag staalafname ---> = medische context moet geschetst zijn
▪ Staalafname zelf
▪ Transport nr labo
▪ Voorbehandeling v stalen
---> er bestaan aanvraagsets op maat ---> bv. op intensieve = altijd zelfde parameters
aanvragen = set ontwikkelen die in 1 keer kan worden aangeduid
---> Klinisch arts mag ook testen schrappen/toevoegen
2. Analytische fase
3. Post-analytische fase
= 2 soorten validaties voor testen =
▪ Technische validatie = kijken of test functioneel goed verlopen is en of
resultaat mogelijk is bij dat soort testen
▪ Klinische validatie = resultaat vgl met andere resultaten v patiënt = in
medische context kijken ---> vermoedelijke diagnose stellen
---> hier ook resultaten rapporteren + eventueel deelname aan multidisciplinair overleg
1/3e van de testen die dr huisartsen worden aangevraagd = overbodig = kost veel geld
1
,Analytische technieken =
1. Fotometrie
= gebaseerd op wet v Lambert-beer --->
---> door reactie = ontstaan of verdwijnen v gekleurde
component in meetcurve = absorberen v kleur/licht
---> Hoeveelheid geabsorbeerd licht = evenredig met aanwezige concentratie van:
- Meeste substraten = bv. glucose + creatinine + Ca + Fe + …
- Alle enzymen
---> testen gebeuren met minimaal verbruik v monster + materiaal
Werking =
Absorbantie bepalen =
Negatieve logaritme nemen v transmissie v licht
---> = verhouding v
- Teller = licht dat gepasseerd is dr cuvet
- Noemer = aantal licht voor passage
---> ook altijd blanco meten = de cuvet zal sws wat
licht absorberen
Biureet reactie =
Eiwit concentratie meten in oplossing ---> = koper complex maken (Cu2+) = heeft paarse kleur
---> intensiteit v kleur = rechtevenredig met hoeveelheid peptidebindingen = hoeveelheid eiwit
---> zo uiteindelijk een standaardcurve uitzetten voor totaal aantal eiwitten =
▪ Y-as = absorbatie bij 540 nm
▪ X-as = eiwitconcentratie
2. Potentiometrie
= elekrochemische methode ---> gebaseerd op wet v Nernst --> = voor metingen v elektrolyten =
- Directe potentiometrie = meting op onverdund staal
- Indirecte potentiometrie = meting op verdund staal
---> = belangrijk want: als persoon aandoening heeft dat componenten v bloed laat
toenemen (bv. hyperlipemie) = elektrolyen in bloed sws verdunnen
---> dus stel indirecte meting uitvoeren = nog meer verdunnen = kan vertekent resultaat
geven
2
,3. Elektroforese
= macromoleculen scheiden obv nettolading oiv elektrisch veld --->
- Kan op gel = gelelektroforese
- In capillair = capillaire elektroforese
---> door verschillende ladingen + vormen = sneller/tragen migreren = onderscheid maken
Soorten elektroforese =
- Eiwitelektroforese = scheiden v eiwitten in serum + urine + CSV ---> = belangrijk bij
diagnostiek v myeloom
- Hb-elektroforese = onderzoek v lysaat v RBC ter detectie v Hb-mutanten =
• HbS bij sikkelcelanemie
• HbA2 bij thalassemie
4. Immunologische assays =
---> 2 belangrijke componenten =
- = Polyklonale of monoklonale antilichamen gebruiken als reagens ---> antigen
detecteren =
• Polyklonaal = allemaal verschillende specificiteit voor pathogeen
• Monoklonaal = allemaal zelfde specificiteit = tegen zelfde epitoop
- Antigen gebruiken om antilichaam v belang te detecteren
---> bepaling v antigen of antilichaam in vitro = enkel mogelijk als antigen-antilichaam binding
zichtbaar kan worden gemaakt =
- Immunoturbidimetrie = immunofelometrie = voor detectie v eiwitten ---> werking =
1. Toevoegen antilichaam
2. Binden aan antigen
3. Fijne nevel ontstaan
4. Immuuncomplexen hierin meten
- Radio-immuno assay (RIA) =
Antigenen in zeer lage concentraties meten ---> competitieve binding ts:
• Radio-actief gelabeld antigeen
• Onbekende antigeen in monster
- Vervangen dr koude alternatieven =
• ELISA = enzyme linked immunosorbent assay
• ECLIA = elektrochemiluniscentie immunoassay
3
, Werkingsprincipe ELISA =
- Directe ELISA =
1. Target proteïne = vasthouden op bodem v
detectieplaats
2. Antilichamen toevoegen tegen antigen = eiwit v
interesse
---> antilichamen = gelabeld met enzymes
3. Niet gebonden antilichamen wegwassen
4. Substraat toevoegen
5. Substraat interageert met enzyme =
kleurreactie ontstaan
---> intensiteit v kleurreactie = maat voor concentratie v
het antigen
- Indirecte ELISA =
= specifiek antilichaam detecteren ---> = gebruik maken v antigenen tg antilichaam =
1. Antigenen inbrengen
2. Monster toevoegen = bevat antilichamen ---> binden aan antigenen
3. Wassen
4. Enzym-gelabeld secundiar antilichaam toevoegen = binden aan primair
antilichaam v patiën
5. Substraat toevoegen = kleurverandering
- Sandwich ELISA =
= Niet beginnen met target eiwit te capteren --->
1. Eerst gebruik maken v wellen die gecoat zijn met antilichamen
2. Antigen v interesse in serum v patiënt = toevoegen
3. Antigen laten binden aan antilichamen
4. Enzym-gelabeld antilichaam toevoegen ---> = bindt aan antilichamen
waaraan target eiwit gebonden is
5. Wassen
6. Substraat toevoegen ---> kleurverandering
Algemene doel ELISA = specifieke antigeen-antilichaamreacties zichtbaar maken en
kwantificeren via kleurreactie
Meten van:
Antigen Antilichaam
- Sandwich ELISA - Indirecte ELISA
- Directe ELISA
4
