Celcultuur & Toxiciteitstesten
Onderhoud celculturen:
- LAF-kast: steriel, ontsmetten kast, producten, handen,…
- Ordening, mag flow niet onderbreken
- Werk met ongecontamineerde celculturen
- Spoel alle cellen; medium boven cellen afzuigen om afvalstoffen en
dode cellen te verwijderen
- Afvalstoffen verlagen zuurtegraad van medium; dus heeft andere
kleur
- Cellen hangen via eiwitbinden vast aan onderkant fles; wordt door
kationen gestabiliseerd
- Spoel cellen 2x met EDTA-oplossing: verwijdert kationen (= EDTA
negatief geladen en complexeert kationen)
- Eiwitbindingen destabiliseren in afwezigheid van kationen (= eerste
spoeling)
- Tweede spoeling zal restjes medium verwijderen
- Cellen hangen nog vast via eiwitbindingen aan onderkant fles, na
spoelingen
- Trypsine is protease dat eiwitbindingen zal verbreken, wordt
geïnactiveerd in aanwezigheid van medium => door serum dat
albumine bevat
- Essentieel dat tweede spoelstap restjes medium verwijdert!!
- Cultuur verdunnen; kan eindig worden uitgevoerd => kans op
mutaties
Nieuwe cultuur maken:
- Voeg vers medium toe aan verse fles
- Altijd mediumfles afsluiten om pH constant te houden, want medium
wordt gebufferd door carbonaatbuffer wat in evenwicht wilt komen
met CO2 uit lucht
- Korte incubatie met trypsine maakt cellen los
- Losgekomen cellen hersuspenderen met vers medium en bekom
celsuspentie die in nieuwe cultuur verdund kan worden
- Toevoeging van vers medium inactiveert trypsine
- Grondige spoeling om interacties tussen cellen en plastiek te
verbreken
- Overgebrachte cellen worden voorzien van voedingstoffen om terug
te kunnen groeien, dankzij toevoeging v vers medium
- Nieuw flesje me verse cultuur half dichtdraaien, zodat wel nog
zuurstof om te kunnen groeien
,!! voor elke stap nieuw steriel materiaal gebruiken => vermijd
contaminatie en mengculturen
Celcultuur
WEEFSELKWEEK: is een algemene term, die zowel naar orgaancultuur
als naar celcultuur refereert (= om alle weefsels in cultuur te brengen)
CELCULTUREN: afgeleid van primaire weefselexplanten of celsuspensies
Primaire celculturen:
o Normale cellen uit lichaam die in cultuur gebracht worden
** bv. Huidcellen in cultuur brengen, fungeren als model
voor huid
!! beperkte levensduur v 3-4 weken, dus niet
langdurig gebruik
o De groei van explanten, die rechtstreeks afkomstig zijn van
een levend organisme (bv. biopsie materiaal), maar deze
primaire celculturen kennen slechts een beperkte levensduur.
Stabiele cellijnen:
o Cellen met onbeperkte levensduur (geïmmortaliseerd), door
mutaties oneindig in cultuur gehouden kunnen worden
o hetzij van tumorale oorsprong, hetzij na “crisis” (selectie) van
culturen, die na verloop van weken verouderen en grotendeels
afsterven
o kan stabiele cellijn bekomen door primaire celcultuur lang in
leven te houden en hopen op mutaties die zorgen voor
immortalisatie
** is omslachtig, weinig gebruikt in realiteit
o vb. HELA-cellen: patiënt die gediagnostiseerd werd met
baarmoederhalskanker, haar cellen zijn nog steeds in cultuur
Nodige condities om aan celcultuur te doen:
1) De steriele werkplaats
- Werk in verticale laminaire
flow
=> lucht wordt van boven
aangezogen
=> lucht door HEPA-filter
sturen en alle
, deeltjes verwijderen
=> luchtstroom verdwijnt door rooster
in ondervlak
=> beschermt cellen en onderzoeken
lucht niet in gezicht geblazen
- Klasse II microbiologische veiligheidswerkbank: zorgt voor een
omgeving waarin steriele en deeltjes-vrije lucht continu circuleert.
- Bescherming van zowel de gebruiker als de cellijnen en de
omgeving.
- Alle werkbanken (“flows”) zijn voorzien van een HEPA-filter (high-
efficiency particulate air) en filtreren elk deeltje > 0.3 μm uit de
luchtstroom.
- werk in horizontale flow
=> lucht aangezogen via achterwand
=> lucht door filter duwen
=> creëer steriele zone in kast
!! gebruiker NIET beschermd
- Horizontale flow kan bij maken
oogdruppels, ongewenst bij gebruik
va kankercellen
- Belang steriele zone:
Cellen hebben verdubbelingstijd van
24-48u
Bacteriën en schimmels hebben
verdubbelingstijd van 1-2u
Bij contaminatie van bacteriën in
celcultuur, zal bacteriële groei deze
cultuur overnemen!!
2) Cultuurmedia
Eerst gebruikt medium: BME (Basal Medium Eagle)
Meest gebruikt medium: DMEM (Dulbecco’s Minimum
Essential Medium)
** dat zich v BME onderscheidt door grotere
hoeveelheid aminozuren
DMEM bevat oa:
Onderhoud celculturen:
- LAF-kast: steriel, ontsmetten kast, producten, handen,…
- Ordening, mag flow niet onderbreken
- Werk met ongecontamineerde celculturen
- Spoel alle cellen; medium boven cellen afzuigen om afvalstoffen en
dode cellen te verwijderen
- Afvalstoffen verlagen zuurtegraad van medium; dus heeft andere
kleur
- Cellen hangen via eiwitbinden vast aan onderkant fles; wordt door
kationen gestabiliseerd
- Spoel cellen 2x met EDTA-oplossing: verwijdert kationen (= EDTA
negatief geladen en complexeert kationen)
- Eiwitbindingen destabiliseren in afwezigheid van kationen (= eerste
spoeling)
- Tweede spoeling zal restjes medium verwijderen
- Cellen hangen nog vast via eiwitbindingen aan onderkant fles, na
spoelingen
- Trypsine is protease dat eiwitbindingen zal verbreken, wordt
geïnactiveerd in aanwezigheid van medium => door serum dat
albumine bevat
- Essentieel dat tweede spoelstap restjes medium verwijdert!!
- Cultuur verdunnen; kan eindig worden uitgevoerd => kans op
mutaties
Nieuwe cultuur maken:
- Voeg vers medium toe aan verse fles
- Altijd mediumfles afsluiten om pH constant te houden, want medium
wordt gebufferd door carbonaatbuffer wat in evenwicht wilt komen
met CO2 uit lucht
- Korte incubatie met trypsine maakt cellen los
- Losgekomen cellen hersuspenderen met vers medium en bekom
celsuspentie die in nieuwe cultuur verdund kan worden
- Toevoeging van vers medium inactiveert trypsine
- Grondige spoeling om interacties tussen cellen en plastiek te
verbreken
- Overgebrachte cellen worden voorzien van voedingstoffen om terug
te kunnen groeien, dankzij toevoeging v vers medium
- Nieuw flesje me verse cultuur half dichtdraaien, zodat wel nog
zuurstof om te kunnen groeien
,!! voor elke stap nieuw steriel materiaal gebruiken => vermijd
contaminatie en mengculturen
Celcultuur
WEEFSELKWEEK: is een algemene term, die zowel naar orgaancultuur
als naar celcultuur refereert (= om alle weefsels in cultuur te brengen)
CELCULTUREN: afgeleid van primaire weefselexplanten of celsuspensies
Primaire celculturen:
o Normale cellen uit lichaam die in cultuur gebracht worden
** bv. Huidcellen in cultuur brengen, fungeren als model
voor huid
!! beperkte levensduur v 3-4 weken, dus niet
langdurig gebruik
o De groei van explanten, die rechtstreeks afkomstig zijn van
een levend organisme (bv. biopsie materiaal), maar deze
primaire celculturen kennen slechts een beperkte levensduur.
Stabiele cellijnen:
o Cellen met onbeperkte levensduur (geïmmortaliseerd), door
mutaties oneindig in cultuur gehouden kunnen worden
o hetzij van tumorale oorsprong, hetzij na “crisis” (selectie) van
culturen, die na verloop van weken verouderen en grotendeels
afsterven
o kan stabiele cellijn bekomen door primaire celcultuur lang in
leven te houden en hopen op mutaties die zorgen voor
immortalisatie
** is omslachtig, weinig gebruikt in realiteit
o vb. HELA-cellen: patiënt die gediagnostiseerd werd met
baarmoederhalskanker, haar cellen zijn nog steeds in cultuur
Nodige condities om aan celcultuur te doen:
1) De steriele werkplaats
- Werk in verticale laminaire
flow
=> lucht wordt van boven
aangezogen
=> lucht door HEPA-filter
sturen en alle
, deeltjes verwijderen
=> luchtstroom verdwijnt door rooster
in ondervlak
=> beschermt cellen en onderzoeken
lucht niet in gezicht geblazen
- Klasse II microbiologische veiligheidswerkbank: zorgt voor een
omgeving waarin steriele en deeltjes-vrije lucht continu circuleert.
- Bescherming van zowel de gebruiker als de cellijnen en de
omgeving.
- Alle werkbanken (“flows”) zijn voorzien van een HEPA-filter (high-
efficiency particulate air) en filtreren elk deeltje > 0.3 μm uit de
luchtstroom.
- werk in horizontale flow
=> lucht aangezogen via achterwand
=> lucht door filter duwen
=> creëer steriele zone in kast
!! gebruiker NIET beschermd
- Horizontale flow kan bij maken
oogdruppels, ongewenst bij gebruik
va kankercellen
- Belang steriele zone:
Cellen hebben verdubbelingstijd van
24-48u
Bacteriën en schimmels hebben
verdubbelingstijd van 1-2u
Bij contaminatie van bacteriën in
celcultuur, zal bacteriële groei deze
cultuur overnemen!!
2) Cultuurmedia
Eerst gebruikt medium: BME (Basal Medium Eagle)
Meest gebruikt medium: DMEM (Dulbecco’s Minimum
Essential Medium)
** dat zich v BME onderscheidt door grotere
hoeveelheid aminozuren
DMEM bevat oa:
