BIOTECHNOLOGIE & PROTEÏNEGENEESMIDDELEN
H1: INLEIDING
- Biologische GM: moleculen die je uit de natuurlijke biologie kan halen
- Gebaseerd op moleculen die ih lichaam voorkomen, = eiwitten
- Bloed- & plasmaproducten = eenvoudigste: eiwitten uit bloeddonatie vrijwilligers = GM!
—> regulatoire vereisten om op de markt te mogen komen
- Fresh frozen plasma, RBC concentraat, gefractioneerde plasma producten
- Bloed / plasma afgenomen: albumine = meest voorkomend, weinig therapeutisch potentieel:
opgezuiverd uit bloed-donatie
- Insuline: recombinant aangemaakt dr bacteriën: ook opzuivering nodig (celmateriaal,
metabolieten, afbraakproducten,..)
- Opzuiveringsstrategie = belangrijk in productieproces GM + kostprijs! (5-7 stappen)
- Partikels moeten eruit: water ( ltratie) —> a niteitschromatogra e (AL die eiwit capteren)
- Belangrijk risico bij bloed uit vrijwilligers: virale contaminatie (minder bij bacteriën)
- Immunoglobuline = AL: ook opzuivering —> GM
- Aangeboren: te weinig IG = ↑ infecties: extra bescherming = IG toedienen (= passief)
- Broodverbeteraars = recombinante eiwitten / enzymes —> goedkoper dan vb insuline
- Brood: 1st gebakken etc: eventuele contaminaties zijn dus weg + weinig bewijs nodig
- Insuline: veel strengere voorwaarden vr veiligheid
- Biotechnologische GM: productie buiten lichaam vd mens (kan wel in ander organisme)
—> nadeel: injectie!
- Recombinante eiwitten (insuline) —> vb: in bacteriën, gist, eieren vn kippen, melk vd koe
- 1ste recombinant GM beschikbaar vr consumenten: recombinant insuline (Genentech)
- Monoklonale antilichamen —> groot, moeilijkere prod, voordeel: op korte tijd GM met hoge
speci citeit & lage tox (o -target e ect = binding op andere receptor), duur
→Na verloop vn tijd: immuunrespons tegen AL = GM werkt niet meer —> drm moet GM
zoveel mogelijk lijken op natuurlijke AL in bloed = veiliger
- Fusie-eiwitten —> fusie minstens 2 andere eiwitten = nieuwe biologische functionaliteiten dr:
op DNA niveau genetische codes aan elkaar koppelen
—> inbrengen in bacterie: maakt 1 eiwit = combo 2 of meer eiwitten
=> voorzichtig zijn vr kans op immuunherkenning
- Vaccins: sommige zijn recombinant, andere geen eiwit-GM (covid = mRNA-vaccin): wel
product vn biotechnologie (= genetisch gemodi ceerd)
- ATMPs = geavanceerde therapeutische GM gebaseerd op genen, weefsels / cellen
- CAR-T-cellen = Cimeric Antigen Receptor T-cells: tegen leukemie
- Cellen afnemen vd patiënt zelf: WBC afzuigen: T-cellen —> doel = andere cellen afdoden
- Combinatie met gentherapie —> werkt op receptoren in T-cellen
- Bezorgdheid: dr gentherapie cellen induceren om zelf tumorcellen te w
- Tissue engineered GM = bevat gemanipuleerde cellen / weefsels, om menselijk weefsel te
regenereren, herstellen / vervangen
- Biotech = gebruik v biologische systemen, levende organismen / derivaten —> GM produceren
—> vaak manipulatie vn DNA, RNA, & eiwitten (niet gwn component uit plant halen)
—> manipulatie die normaal niet id natuur spontaan zou plaatsvinden
- CRISPR-Cas: mutatie —> eigenschappen organisme wijzigen nuttig vr therapeutisch doel
(gen niet meer tot expressie)
- Regulatoir: complexe producten —> guidelines (constant aangepast)!
- Verplichte centrale route —> via FDA (USA), EU: GM op de markt = per land
=> EMA = European Medicine Agency (zoals FDA)
- Nieuwe actieve bestanddelen vr: AIDS, kanker, diabetisch, neurologisch, auto-immuun,
virale ziektes, genetische technologie, orphan GM (vr ziektes die niet veel voorkomen)
1
fi ff fi ff ffi fi fi
,2
, H2: EIWITTEN & TRANSLATIE
- Signaalsequentie: zorgt dat recomb eiwit dat je wil aanmaken op bepaalde plaats id cel komt
—> cytoplasma / secretie cultuurmedium / periplasmatische ruimte rond bacterie / Golgi lumen
—> afhankelijk vn sequentie
- Peptidase = speci ek enzym: knipt DNA —> eiwit secretie in ER
—> in ER / Golgi apparaat: andere eiwitten / enzymen aanwezig die het eiwit kn modi ceren
= post-translationele modi caties —> meer verschil in eiwitten dan enkel de versch AZ
- Insuline-eiwit w ook geknipt dr enzymes = eig ook een post-translationele modi catie
Post-Translationele Modi caties (chemisch):
1. Glycosylaties = complex: alle blokjes id structuur = ander suiker-residu
—> kn gekoppeld w als polysachariden: gekoppeld op eiwit: typisch in ER & Golgi
- Glycoproteïnen = eiwit met minstens 1 suiker-residu aan gekoppeld
- 70% vd biotech GM (incl. mAb) = glycoproteïnen
- N-linked = suikers gekoppeld op N-residu vn eiwit:
enkel in eukaryoten (niet in E.coli)
- In ER & Golgi systeem
- Typisch op asparagine
- Vooral op degene id consensus sequentie
= Asn-X-Ser/Thr —> typisch niet N-link & O-link dichtbij elkaar
- Core pentasaccharide = “geconserveerd”: N-linked polysach: gemeenschappelijk
- 2 N-acetylglucosamine-residuen
- 3 mannose-residuen
- Antennes = vertakking
- Op 1 eiwit (= versch eiwit-molecules): versch vertakkingen
- Trimming & branching:
- Eiwit in ER: enzymes nodig vr verch glycosylaties —> versch iso-vormen
- 1st oligosach koppeling op asparagine
- Trimming = versch enzymes knippen stukjes vn oligosach tot bij conserved sequentie
- Branching = enzymes zetten er nieuwe takjes op
- Op bepaald moment: zal vr zelfde eiwit elk vd versch iso-vormen voorkomen!
- Iso-vorm verdeling is niet altijd hetzelfde
- Comparabiliteit-studies = aantonen dat glycoprot dr de complexiteit als je het upscaled nr
grotere productie nog altijd grotendeels dezelfde iso-vormen vh proteïne zijn (marge)
- Generisch GM = klassieke, kleine molecules die via chemische synthese w gemaakt
(ibuprofen, paracetamol, acetylsalicylzuur) —> via analytische methodes analyseren: via
ander bedrijf kan exact zelfde gemaakt w (geen klinische studies vr op de markt)
- Bio-similar GM = kopie maken vh glycoproteïne = groter, complexer
—> wel klinische studies nodig (similar = gelijkaardig, nooit perfect zelfde)
- O-linked = polysach gekoppeld op O-residu vn eiwit: enkel in Golgi systeem
- Typisch op serine (of op threonine)
- Relatief eenvoudige polysachariden = “oligosachariden”
- Niet in alle eukaryoten op zelfde manier
- Gist-cellen: typisch high-mannose glycosylaties —> therapeutisch niet-bruikbaar
- Humaan / gist / niet-humane zoogdieren / planten: visueel niet hetzelfde
- Vr elk vd vertakkingen: enzymes nodig
—> mens: mutatie in 1 vd genen die codeert vr 1 vd enzymes => afwijking glycosylaties
—> versch biologische werking glycoprot: immunogeniciteit: GM moet lijken op humaan
—> immuunsysteem mag het prot-GM liefst niet zien als lichaamsvreemd: antilichamen
- Toch werken we liever met niet-humane zoogdiercellen: (humaan: kan virussen bevatten)
—> virale contaminatie = minder gevaarlijk vr de mens: enkel infectie dier, niet de mens
—> zoogdiercelculturen: zelfde mutaties als bij de mens => bijna identieke glycosylaties
3
fi fifi fi fi
, - Expressie systemen
- Bacterien: geen glycosylaties (kan wel geëngineerd w)
- Gisten:
- Hypermannosylatie = antigeen vr de mens —> wss immuun-respons uitlokken
= gewenst in speci eke gevallen: vaccins
- Andere serine residues ge-O-glycosyleerd
- Pichia pastoris = schimmel vr productie enzymes
- Zoogdiercel culturen:
- Meeste zoogdiercellen maken antigene glycosilatie aan
- Humane (virale contaminatie), apecellen, CHO & baby hamster kidney (BHK) niet
- CHO = Chinese Hamster Ovary cell: tumor-cellen uit ovaria hamster
—> ook mutatie in gen dat codeert vr 1 vd enzymes betrokken bij glycosylatie
= gelijkaardig als bij de mens
- BHK = Baby Hamster Kidney cells: niertumorcellen uit baby hamster
2. Disul de binding = stabilisatie secundaire, tertiaire, quaternaire structuur
- Monoklonale AL = 2 lichte & 2 zware ketens: via disul debruggen aan elkaar vastgekoppeld
in lichaam id pericellen
- Sommige bact: rond celmembraan nog celwand —> hiertssn: periplasmatische ruimte
- E.coli: vorming disul de-brug enkel in periplasma
—> kan wel geëngineerd w = genetisch manipuleren
=> eiwitten tot expressie die wel zorgen dat disul debrug gevormd w in vb cytoplasma
- Eukaryoten: dr oxidatieve enzymatsiche stappen in ER —> samenwerking enzymes
- Insuline (klein eiwit): bijzondere vorm: bestaat uit 2 korte polypeptide-ketens
—> via 2 disul debruggen aan elkaar vast (intra-chain) + disul de-brug id A-keten
—> geproduceerd in E.coli bact
- Insuline = geen glycoprot
3. Fosforylaties = weinig stabiel = minder belangrijk: typisch niet in biotech-GM / eiwitten
- Biologisch wel belangrijk: zorgt vr activatiestatus eiwit
- Kan overgedragen w vn ene nr andere eiwit: verteld activatiestatus dr
4. Sulfatatie:
- Tyrosinesulfatatie dr TyrosylProteïneSulfoTransferase (TPST), in Golgi- apparaat
- Bij gesecreteerde eiwitten & extracellulaire delen vn membraaneiwitten
- Sulfatatie bij dieren & planten, niet bij prokaryoten / gisten
- Minder belangrijk
- Karakterisatie eiwit: als GM op markt —> rekening houden met mogelijke sulfataties
4
fi fi fi fi fi fi fi
H1: INLEIDING
- Biologische GM: moleculen die je uit de natuurlijke biologie kan halen
- Gebaseerd op moleculen die ih lichaam voorkomen, = eiwitten
- Bloed- & plasmaproducten = eenvoudigste: eiwitten uit bloeddonatie vrijwilligers = GM!
—> regulatoire vereisten om op de markt te mogen komen
- Fresh frozen plasma, RBC concentraat, gefractioneerde plasma producten
- Bloed / plasma afgenomen: albumine = meest voorkomend, weinig therapeutisch potentieel:
opgezuiverd uit bloed-donatie
- Insuline: recombinant aangemaakt dr bacteriën: ook opzuivering nodig (celmateriaal,
metabolieten, afbraakproducten,..)
- Opzuiveringsstrategie = belangrijk in productieproces GM + kostprijs! (5-7 stappen)
- Partikels moeten eruit: water ( ltratie) —> a niteitschromatogra e (AL die eiwit capteren)
- Belangrijk risico bij bloed uit vrijwilligers: virale contaminatie (minder bij bacteriën)
- Immunoglobuline = AL: ook opzuivering —> GM
- Aangeboren: te weinig IG = ↑ infecties: extra bescherming = IG toedienen (= passief)
- Broodverbeteraars = recombinante eiwitten / enzymes —> goedkoper dan vb insuline
- Brood: 1st gebakken etc: eventuele contaminaties zijn dus weg + weinig bewijs nodig
- Insuline: veel strengere voorwaarden vr veiligheid
- Biotechnologische GM: productie buiten lichaam vd mens (kan wel in ander organisme)
—> nadeel: injectie!
- Recombinante eiwitten (insuline) —> vb: in bacteriën, gist, eieren vn kippen, melk vd koe
- 1ste recombinant GM beschikbaar vr consumenten: recombinant insuline (Genentech)
- Monoklonale antilichamen —> groot, moeilijkere prod, voordeel: op korte tijd GM met hoge
speci citeit & lage tox (o -target e ect = binding op andere receptor), duur
→Na verloop vn tijd: immuunrespons tegen AL = GM werkt niet meer —> drm moet GM
zoveel mogelijk lijken op natuurlijke AL in bloed = veiliger
- Fusie-eiwitten —> fusie minstens 2 andere eiwitten = nieuwe biologische functionaliteiten dr:
op DNA niveau genetische codes aan elkaar koppelen
—> inbrengen in bacterie: maakt 1 eiwit = combo 2 of meer eiwitten
=> voorzichtig zijn vr kans op immuunherkenning
- Vaccins: sommige zijn recombinant, andere geen eiwit-GM (covid = mRNA-vaccin): wel
product vn biotechnologie (= genetisch gemodi ceerd)
- ATMPs = geavanceerde therapeutische GM gebaseerd op genen, weefsels / cellen
- CAR-T-cellen = Cimeric Antigen Receptor T-cells: tegen leukemie
- Cellen afnemen vd patiënt zelf: WBC afzuigen: T-cellen —> doel = andere cellen afdoden
- Combinatie met gentherapie —> werkt op receptoren in T-cellen
- Bezorgdheid: dr gentherapie cellen induceren om zelf tumorcellen te w
- Tissue engineered GM = bevat gemanipuleerde cellen / weefsels, om menselijk weefsel te
regenereren, herstellen / vervangen
- Biotech = gebruik v biologische systemen, levende organismen / derivaten —> GM produceren
—> vaak manipulatie vn DNA, RNA, & eiwitten (niet gwn component uit plant halen)
—> manipulatie die normaal niet id natuur spontaan zou plaatsvinden
- CRISPR-Cas: mutatie —> eigenschappen organisme wijzigen nuttig vr therapeutisch doel
(gen niet meer tot expressie)
- Regulatoir: complexe producten —> guidelines (constant aangepast)!
- Verplichte centrale route —> via FDA (USA), EU: GM op de markt = per land
=> EMA = European Medicine Agency (zoals FDA)
- Nieuwe actieve bestanddelen vr: AIDS, kanker, diabetisch, neurologisch, auto-immuun,
virale ziektes, genetische technologie, orphan GM (vr ziektes die niet veel voorkomen)
1
fi ff fi ff ffi fi fi
,2
, H2: EIWITTEN & TRANSLATIE
- Signaalsequentie: zorgt dat recomb eiwit dat je wil aanmaken op bepaalde plaats id cel komt
—> cytoplasma / secretie cultuurmedium / periplasmatische ruimte rond bacterie / Golgi lumen
—> afhankelijk vn sequentie
- Peptidase = speci ek enzym: knipt DNA —> eiwit secretie in ER
—> in ER / Golgi apparaat: andere eiwitten / enzymen aanwezig die het eiwit kn modi ceren
= post-translationele modi caties —> meer verschil in eiwitten dan enkel de versch AZ
- Insuline-eiwit w ook geknipt dr enzymes = eig ook een post-translationele modi catie
Post-Translationele Modi caties (chemisch):
1. Glycosylaties = complex: alle blokjes id structuur = ander suiker-residu
—> kn gekoppeld w als polysachariden: gekoppeld op eiwit: typisch in ER & Golgi
- Glycoproteïnen = eiwit met minstens 1 suiker-residu aan gekoppeld
- 70% vd biotech GM (incl. mAb) = glycoproteïnen
- N-linked = suikers gekoppeld op N-residu vn eiwit:
enkel in eukaryoten (niet in E.coli)
- In ER & Golgi systeem
- Typisch op asparagine
- Vooral op degene id consensus sequentie
= Asn-X-Ser/Thr —> typisch niet N-link & O-link dichtbij elkaar
- Core pentasaccharide = “geconserveerd”: N-linked polysach: gemeenschappelijk
- 2 N-acetylglucosamine-residuen
- 3 mannose-residuen
- Antennes = vertakking
- Op 1 eiwit (= versch eiwit-molecules): versch vertakkingen
- Trimming & branching:
- Eiwit in ER: enzymes nodig vr verch glycosylaties —> versch iso-vormen
- 1st oligosach koppeling op asparagine
- Trimming = versch enzymes knippen stukjes vn oligosach tot bij conserved sequentie
- Branching = enzymes zetten er nieuwe takjes op
- Op bepaald moment: zal vr zelfde eiwit elk vd versch iso-vormen voorkomen!
- Iso-vorm verdeling is niet altijd hetzelfde
- Comparabiliteit-studies = aantonen dat glycoprot dr de complexiteit als je het upscaled nr
grotere productie nog altijd grotendeels dezelfde iso-vormen vh proteïne zijn (marge)
- Generisch GM = klassieke, kleine molecules die via chemische synthese w gemaakt
(ibuprofen, paracetamol, acetylsalicylzuur) —> via analytische methodes analyseren: via
ander bedrijf kan exact zelfde gemaakt w (geen klinische studies vr op de markt)
- Bio-similar GM = kopie maken vh glycoproteïne = groter, complexer
—> wel klinische studies nodig (similar = gelijkaardig, nooit perfect zelfde)
- O-linked = polysach gekoppeld op O-residu vn eiwit: enkel in Golgi systeem
- Typisch op serine (of op threonine)
- Relatief eenvoudige polysachariden = “oligosachariden”
- Niet in alle eukaryoten op zelfde manier
- Gist-cellen: typisch high-mannose glycosylaties —> therapeutisch niet-bruikbaar
- Humaan / gist / niet-humane zoogdieren / planten: visueel niet hetzelfde
- Vr elk vd vertakkingen: enzymes nodig
—> mens: mutatie in 1 vd genen die codeert vr 1 vd enzymes => afwijking glycosylaties
—> versch biologische werking glycoprot: immunogeniciteit: GM moet lijken op humaan
—> immuunsysteem mag het prot-GM liefst niet zien als lichaamsvreemd: antilichamen
- Toch werken we liever met niet-humane zoogdiercellen: (humaan: kan virussen bevatten)
—> virale contaminatie = minder gevaarlijk vr de mens: enkel infectie dier, niet de mens
—> zoogdiercelculturen: zelfde mutaties als bij de mens => bijna identieke glycosylaties
3
fi fifi fi fi
, - Expressie systemen
- Bacterien: geen glycosylaties (kan wel geëngineerd w)
- Gisten:
- Hypermannosylatie = antigeen vr de mens —> wss immuun-respons uitlokken
= gewenst in speci eke gevallen: vaccins
- Andere serine residues ge-O-glycosyleerd
- Pichia pastoris = schimmel vr productie enzymes
- Zoogdiercel culturen:
- Meeste zoogdiercellen maken antigene glycosilatie aan
- Humane (virale contaminatie), apecellen, CHO & baby hamster kidney (BHK) niet
- CHO = Chinese Hamster Ovary cell: tumor-cellen uit ovaria hamster
—> ook mutatie in gen dat codeert vr 1 vd enzymes betrokken bij glycosylatie
= gelijkaardig als bij de mens
- BHK = Baby Hamster Kidney cells: niertumorcellen uit baby hamster
2. Disul de binding = stabilisatie secundaire, tertiaire, quaternaire structuur
- Monoklonale AL = 2 lichte & 2 zware ketens: via disul debruggen aan elkaar vastgekoppeld
in lichaam id pericellen
- Sommige bact: rond celmembraan nog celwand —> hiertssn: periplasmatische ruimte
- E.coli: vorming disul de-brug enkel in periplasma
—> kan wel geëngineerd w = genetisch manipuleren
=> eiwitten tot expressie die wel zorgen dat disul debrug gevormd w in vb cytoplasma
- Eukaryoten: dr oxidatieve enzymatsiche stappen in ER —> samenwerking enzymes
- Insuline (klein eiwit): bijzondere vorm: bestaat uit 2 korte polypeptide-ketens
—> via 2 disul debruggen aan elkaar vast (intra-chain) + disul de-brug id A-keten
—> geproduceerd in E.coli bact
- Insuline = geen glycoprot
3. Fosforylaties = weinig stabiel = minder belangrijk: typisch niet in biotech-GM / eiwitten
- Biologisch wel belangrijk: zorgt vr activatiestatus eiwit
- Kan overgedragen w vn ene nr andere eiwit: verteld activatiestatus dr
4. Sulfatatie:
- Tyrosinesulfatatie dr TyrosylProteïneSulfoTransferase (TPST), in Golgi- apparaat
- Bij gesecreteerde eiwitten & extracellulaire delen vn membraaneiwitten
- Sulfatatie bij dieren & planten, niet bij prokaryoten / gisten
- Minder belangrijk
- Karakterisatie eiwit: als GM op markt —> rekening houden met mogelijke sulfataties
4
fi fi fi fi fi fi fi
