Samenvatting geïntegreerd practicum moleculaire biologie en genetica

THEORIE GEÏNTEGREERD
PRACTICUM
AFKORTINGEN
EXPERIMENT 1

 SDH: Succinaat DeHydrogenase
 TTC: Triphenyl Tetrazolium Chloride
 TCA: TriChloor Azijnzuur

EXPERIMENT 2

 LDH: Lactaat DeHydrogenase
 AS: AmmoniumSulfaat
 DEAE: DiEthylAminoEthyl
 SDS: NatriumDodecylSulfaat

EXPERIMENT 1: SDH-BEPALING

 SDH: komt voor in de mitochondriën
o Membraangebonden eiwit
o Maakt deel uit van citroenzuurcyclus & oxidatieve fosforylering
o Katalyseert de stap waarbij succinaat geoxideerd wordt tot fumaraat
 SDH-essay:
o Bepaling door kwantitatieve reductie van TTC tot rood, water onoplosbaar formazan (kleurreactie)
 Hoeveelheid kleur evenredig met SDH-activiteit
 Succinaat als substraat
 Omzetting bij 480 nm
 Cofactor gebruikt: FAD + 2 e- + 2 H+  FADH2
 Natrium dithioniet zorgt voor omzetting TTC naar formazan  opstellen ijklijn.
 Aceton: oplossen formazan neerslag  OD-bepaling
 Cellen in sucrose-oplossing  in water barsten ze door osmose
 Weefselfractionaties op ijs bewaren  inhibitie proteasen, komen vrij bij de weefselfractionatie
 Differentiële centrifugatie: nooit 100% volledige scheiding
o Scheiding partikels afhankelijk van de grootte
o Organellen slaan neer bij verschillende G-krachten
- Kernen: hoge G-krachten
- Mitochondriën: lage G-krachten
 Potter-Elvejhem homogenisator:
o Bestaat uit glazen buis en teflon-stamper
o Kleine ruimte tussen buis en stamper
o Cellen komen terecht in de ruimte en worden gebroken door de druk, organellen blijven intact.
 Gebruikt om organellen uit de cel te halen.
o Alternatief: mixer maar organellen gaan kapot.

,  Blanco: SDH-essay zonder substraat  meten achtergrondruis.

 Drooggewicht bepaald door:
o Berekening aantal gram weefsel per mL weefselfractie
o Berekening extinctiecoëfficiënt
o Controle correctheid colorische methode
 Bij drooggewicht bepaling wordt TCA toegevoegd  denaturatie eiwitten.

EXPERIMENT 2: AFZONDERING LDH-5 ISO-ENZYM UIT LEVERWEEFSEL

 LDH komt voor in bijna alle cellen, voornamelijk: hart, lever, RBC, spieren, longen en hersenen.
o Komt vrij bij beschadiging cellen
o Katalyseert reversibele reactie lactaat  pyruvaat: pyruvaat + NADH + H+  L-lactaat + NAD+
o Omzetting waarneembaar bij 340 nm
o Cofactor: NADH
 LDH kan onderverdeeld worden in 5 iso-enzymen:
1. LDH-1: hart
2. LDH-2: reticulo endotheliale systeem
3. LDH-3: longen
4. LDH-4: pancreas, nier, placenta
5. LDH-5: lever en spier
 TE-buffer zorgt dat DNA en RNA oplosbaar worden zonder afgebroken te worden.
 Testen van de zuiverheid door:
o Eiwit- en enzym assays
o SDS-page, westernblotting, natieve elektroforetische isoenzymscheiding.
 Ammoniumprecipitatie (zoutprecipitatie)
o Soort uitzouten
o Eiwitten scheiden op basis van oplosbaarheid in stijgende ammoniumsulfaat concentraties
o Hoe hoger [AS] hoe lager de oplosbaarheid
Verklaring: AS gaat met eiwitten in competitie treden voor de binding aan watermoleculen voor de
vorming van watermantel. Als zouten de watermoleculen in beslag nemen gaan de eiwitten geen
watermantel meer kunnen vormen en gaan samenklitten  neerslag.
 Dialyse: zout uit de oplossing loopt door semi-permeabel membraan, de te grote eiwitten kunnen er niet
mee door.
o Zorgt voor verwijdering overmaat AS.
o Cut-off waarde en concentratiegradiënt:
- MW < cut-off: vrije diffusie
- MW > cut-off: geen diffusie
o Volume dialysehuls neemt toe want vloeistof uit maatcilinder loopt door osmose in de huls d.m.v. het
semi-permeabel membraan.
o TE-buffer
 LDH-enzym assay: gebaseerd op omzetting NADH naar NAD+ door een enzymatische reactie
o Concentratie LDH bepaald
o Testreagens (NADH + pyruvaat) voor reactie te laten doorgaan
o Veranderingen in absorptie per tijdseenheid meten.
 Eiwittest (Bradford): bepaling totale eiwitconcentratie in staal