Hoofdstuk 1: prepareren en observeren van cellen en weefsels
Preparen
Doel van prepareren: cellen en weefsel zichtbaar maken want laat weinig licht door en weinig
contrasterend.
Cellen preparen
Cellijnen creëren
Niet stabiel (na een aantal passages (splitsen van cellen) veranderen cellen)
Stappen:
1. Weefsels zal enzymatisch worden behandeld
2. Cellen zakken uit/naar bodem gecentrifugeerd
3. Cellen uitgeplaat in groeirecipient
4. Als confluente laag van cellen, cellen losmaken + splitsen
*je kunt ook stabiele cellijnen aankopen van celbanken
Cultuurcondities
Condities van in vivo nabootsen in vitro
1. Wat zit in medium
- Isotonische zouten (o.a. NaHCO3/H2CO3-buffer zoals in bloed)
- Energiebron (glucose)
- Essentiële aminozuren en vitamines
- Serum (onduidelijk wat erin zit, kwaliteitsvariatie!)
2. Hoe bewaar je cellijn
- Atmosfeer 5% CO2
- Warmte
3. Wat is een substraat
Fysische drager waarop de adherente cellen (niet-tumorcellen, stoppen met groeien
door niet voldoende medium) zich aanhechten => cellulaire adhesie en cel spreiding
Beschermer tegen anoïkis (vorm van geprogrammeerde celdood/apoptose)
Niet noodzakelijk voor bloedcellen en tumorcellen
Bv. Plastic, coatings (collageen,)
Celtransfer
Nodig als er een monolaag van cellen is gevormd, want door contactinhibitie (komt bij
tumorcellen minder voor waardoor ze op elkaar kunnen groeien) is het toevoegen van nieuw
medium niet zeer efficiënt. Het transfereren is dus nuttiger. Bij adherente cellen zal dit
,gebeuren door de cultuur in dochterculturen te splitsen met trypsine-EDTA (maagprotease,
degradeert oppervlakte-eiwitten, adhesiemoleculen verbreken).
Weefsels prepareren
1) Fixeren
Na een weefselstukje uit in vivo situatie te nemen, degradeert het door
afbraakenzymen. De activiteit van deze enzymen moet dus tegengegaan worden door
denaturatie. Dit kan op twee manieren:
1. Bevriezen van weefsel: gebruik bij nood aan snelle diagnose
2. Chemische fixatiemiddelen gebruiken: formol (LM), glutaraldehyde (EM),
alcohol/aceton, gebruik bij nood aan betere morfologie
Artefacten: veranderingen in het weefsel ontstaan door fixatie
2) Clearing (enkel bij chemische fixatie)
Aangezien er water in de weefsel zit willen we dit voor het inbedden eruit krijgen met
behulp van alcohol. Daarna clearing m.b.v. tolueen (mengbaar met alcohol en
hydrofobe inbedmiddel)
3) Inbedden (enkel bij chemische fixatie)
Met inbedmiddel het weefsel indringen. De substantie wordt hard waardoor het
materiaal kan gesneden worden in coupes.
Inbedmiddelen: plastic, paraffine, hars (meestal hydrofoob)
4) Snijden
- Bevroren weefsel: snijden met vriesmicrotoom
- Chemisch gefixeerde weefsels:
• Paraffine: LM, vrij zacht, coupes = 5-10 μm, stalen messen nodig, op
draagglaasjes
• Harsen en plastics: EM, harder, coupes = 60-70 nm, minder geschikt voor
immuunkleuringen, glazen/diamanten messen nodig, op metalen grids
5) Kleuren
Hematoxiline/Eosine kleuring= roze en paar
- Hematoxyline: moet i complex met aluminiumzouten, basische kleurstof, reageert
met negatief geladen, basofiele bestandsdelen, kleurt paars, bv kernen
- Eosine: zure kleurstof, reageert met positief geladen, acidofiele componenten, kleurt
roze, bv cytoplasma
Andere kleurstoffen kunnen vetten aanduiden, antilichamen of enzymen
Fluorochrome kleurstof:
• Ion gevoelige kleurstoffen: de fluorescentie hang af van de concentratie ionen
• Immunofluorescentie microscopie: specifieke eiwitten detecteren met
antilichamen
• Tagging van eiwitten: specifieke eiwitten detecteren
, Kleuring voor EM: samen toegepast, nodig voor verhoging van densiteitsverschillen
• Negatieve kleuring: zwaar metaal wordt overmatig aangebracht, het specimen
neemt dit niet op en kleurt wit t.o.v. een zwarte achtergrond
• Schadowing en rotary shadowing: zwaar metaal wordt schuin aangebracht
• Uranylacetaat, lood en osmium: zware metalen die elektronen weerkaatsen
Stamcellen
= cel die zich voortdurend kan delen en differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere
soorten cellen/weefsels
Twee belangrijke eigenschappen:
1) Vermogen tot zelfvernieuwing, waarbij ze zichzelf delen en kopieën van zichzelf maken
2) Het vermogen om te differentiëren, waardoor de volwassen celtypen ontstaan die
onze organen en weefsels vormen
Totipotente stamcellen: kunnen zich tot een volledige foetus ontwikkelen
Pluripotente stamcellen: ze kunnen zich niet meer tot alle verschillende celtypen
differentiëren => we kunnen er geen embryo uit maken maar wel allerlei organen en cellen, is
embryonaal
Ooit uit embryo’s gehaald => in collectie, mag nu niet meer want niet ethisch verantwoord.
Nu geïnduceerde pluripotente stamcellen: gewone cellen afnemen en met enzymen
behandelen. Met deze stamcellen kun je modellen maken of terug gezond aan de patiënt
geven
Multipotente stamcellen: kunnen zich ontwikkelen tot verschillende soorten celtypen maar
niet alle celtypen bv enkel de cellen met betrekking op het bloed
Kwaliteitscontrole
Contaminatie met micro-organismen
Zullen snel groeien in rijke groeimilieus
Bv: bacteriën, gisten, schimmels en antibioticaresistente mycoplasma ’s (parasitair, verzuren
het milieu, moeilijk detecteerbaar + elemineerbaar)
Zuiverheid
Kijken naar karyotypering (aantal en vorm)
, Observeren
Lichtmicroscoop
Klaarveldmicroscoop = Klassieke lichtmicroscoop
Optiek bestaat uit drie lenssystemen:
1. Condensor: bundelt licht op preparaat
2. Objectief: bepaalt samen belichting
lichtsterkte, resolutie en kwaliteit van beeld, vormt
vergroot beeld
3. Oculairen: navergroting
Soms is het nodig om olie of water
tussen het objectief en het
preparaat te brengen voor een
goede resolutie.
LM voor levende cellen
1) Fasecontrast-LM: faseverschuiving van licht +/- interferentie
(A) Gekleurde cel zal amplitude van
golflengtes van licht reduceren => kleurvorming
(B) Binnenin cel: verschil in optische dichtheid
=> faseverschuiving van golflengte van licht
wordt daarna herleid tot zwart wit beeld
Dit zal al een mooier beeld zijn dan klaarveld
2) Differentieel interferentie contrast microscoop: positieve/negatieve interferentie van
gepolariseerd licht, zie ook afbeelding hierboven met uitleg, mooier dan fasecontrast
3) Digitale microscoop
4) Fluorescentie microscoop = epifluoresecentie
Exitatielicht (licht met korte golflengte door filter te gebruiken) gebruiken dat valt op
materiaal waardoor het emissielicht (licht van een grotere golflengte) gaat uitzenden.
Ook moet op het preparaat fluorochrome stof worden aangebracht. Het is deze stof
die het emissielicht zal uitzenden op twee manieren:
- Conventioneel: vaak niet zo scherp want je bekijkt meerdere lagen
- Confocale laserscanning microscopie: veel scherper maar duurder want je bekijkt
maar 1 laag, dit doe je door gebruikt te maken van pin holes (sleutelgaten), gaat
meestal vrij traag tenzij gebruik wordt gemaakt van een spinning disk
Preparen
Doel van prepareren: cellen en weefsel zichtbaar maken want laat weinig licht door en weinig
contrasterend.
Cellen preparen
Cellijnen creëren
Niet stabiel (na een aantal passages (splitsen van cellen) veranderen cellen)
Stappen:
1. Weefsels zal enzymatisch worden behandeld
2. Cellen zakken uit/naar bodem gecentrifugeerd
3. Cellen uitgeplaat in groeirecipient
4. Als confluente laag van cellen, cellen losmaken + splitsen
*je kunt ook stabiele cellijnen aankopen van celbanken
Cultuurcondities
Condities van in vivo nabootsen in vitro
1. Wat zit in medium
- Isotonische zouten (o.a. NaHCO3/H2CO3-buffer zoals in bloed)
- Energiebron (glucose)
- Essentiële aminozuren en vitamines
- Serum (onduidelijk wat erin zit, kwaliteitsvariatie!)
2. Hoe bewaar je cellijn
- Atmosfeer 5% CO2
- Warmte
3. Wat is een substraat
Fysische drager waarop de adherente cellen (niet-tumorcellen, stoppen met groeien
door niet voldoende medium) zich aanhechten => cellulaire adhesie en cel spreiding
Beschermer tegen anoïkis (vorm van geprogrammeerde celdood/apoptose)
Niet noodzakelijk voor bloedcellen en tumorcellen
Bv. Plastic, coatings (collageen,)
Celtransfer
Nodig als er een monolaag van cellen is gevormd, want door contactinhibitie (komt bij
tumorcellen minder voor waardoor ze op elkaar kunnen groeien) is het toevoegen van nieuw
medium niet zeer efficiënt. Het transfereren is dus nuttiger. Bij adherente cellen zal dit
,gebeuren door de cultuur in dochterculturen te splitsen met trypsine-EDTA (maagprotease,
degradeert oppervlakte-eiwitten, adhesiemoleculen verbreken).
Weefsels prepareren
1) Fixeren
Na een weefselstukje uit in vivo situatie te nemen, degradeert het door
afbraakenzymen. De activiteit van deze enzymen moet dus tegengegaan worden door
denaturatie. Dit kan op twee manieren:
1. Bevriezen van weefsel: gebruik bij nood aan snelle diagnose
2. Chemische fixatiemiddelen gebruiken: formol (LM), glutaraldehyde (EM),
alcohol/aceton, gebruik bij nood aan betere morfologie
Artefacten: veranderingen in het weefsel ontstaan door fixatie
2) Clearing (enkel bij chemische fixatie)
Aangezien er water in de weefsel zit willen we dit voor het inbedden eruit krijgen met
behulp van alcohol. Daarna clearing m.b.v. tolueen (mengbaar met alcohol en
hydrofobe inbedmiddel)
3) Inbedden (enkel bij chemische fixatie)
Met inbedmiddel het weefsel indringen. De substantie wordt hard waardoor het
materiaal kan gesneden worden in coupes.
Inbedmiddelen: plastic, paraffine, hars (meestal hydrofoob)
4) Snijden
- Bevroren weefsel: snijden met vriesmicrotoom
- Chemisch gefixeerde weefsels:
• Paraffine: LM, vrij zacht, coupes = 5-10 μm, stalen messen nodig, op
draagglaasjes
• Harsen en plastics: EM, harder, coupes = 60-70 nm, minder geschikt voor
immuunkleuringen, glazen/diamanten messen nodig, op metalen grids
5) Kleuren
Hematoxiline/Eosine kleuring= roze en paar
- Hematoxyline: moet i complex met aluminiumzouten, basische kleurstof, reageert
met negatief geladen, basofiele bestandsdelen, kleurt paars, bv kernen
- Eosine: zure kleurstof, reageert met positief geladen, acidofiele componenten, kleurt
roze, bv cytoplasma
Andere kleurstoffen kunnen vetten aanduiden, antilichamen of enzymen
Fluorochrome kleurstof:
• Ion gevoelige kleurstoffen: de fluorescentie hang af van de concentratie ionen
• Immunofluorescentie microscopie: specifieke eiwitten detecteren met
antilichamen
• Tagging van eiwitten: specifieke eiwitten detecteren
, Kleuring voor EM: samen toegepast, nodig voor verhoging van densiteitsverschillen
• Negatieve kleuring: zwaar metaal wordt overmatig aangebracht, het specimen
neemt dit niet op en kleurt wit t.o.v. een zwarte achtergrond
• Schadowing en rotary shadowing: zwaar metaal wordt schuin aangebracht
• Uranylacetaat, lood en osmium: zware metalen die elektronen weerkaatsen
Stamcellen
= cel die zich voortdurend kan delen en differentiëren (ontwikkelen) in verschillende andere
soorten cellen/weefsels
Twee belangrijke eigenschappen:
1) Vermogen tot zelfvernieuwing, waarbij ze zichzelf delen en kopieën van zichzelf maken
2) Het vermogen om te differentiëren, waardoor de volwassen celtypen ontstaan die
onze organen en weefsels vormen
Totipotente stamcellen: kunnen zich tot een volledige foetus ontwikkelen
Pluripotente stamcellen: ze kunnen zich niet meer tot alle verschillende celtypen
differentiëren => we kunnen er geen embryo uit maken maar wel allerlei organen en cellen, is
embryonaal
Ooit uit embryo’s gehaald => in collectie, mag nu niet meer want niet ethisch verantwoord.
Nu geïnduceerde pluripotente stamcellen: gewone cellen afnemen en met enzymen
behandelen. Met deze stamcellen kun je modellen maken of terug gezond aan de patiënt
geven
Multipotente stamcellen: kunnen zich ontwikkelen tot verschillende soorten celtypen maar
niet alle celtypen bv enkel de cellen met betrekking op het bloed
Kwaliteitscontrole
Contaminatie met micro-organismen
Zullen snel groeien in rijke groeimilieus
Bv: bacteriën, gisten, schimmels en antibioticaresistente mycoplasma ’s (parasitair, verzuren
het milieu, moeilijk detecteerbaar + elemineerbaar)
Zuiverheid
Kijken naar karyotypering (aantal en vorm)
, Observeren
Lichtmicroscoop
Klaarveldmicroscoop = Klassieke lichtmicroscoop
Optiek bestaat uit drie lenssystemen:
1. Condensor: bundelt licht op preparaat
2. Objectief: bepaalt samen belichting
lichtsterkte, resolutie en kwaliteit van beeld, vormt
vergroot beeld
3. Oculairen: navergroting
Soms is het nodig om olie of water
tussen het objectief en het
preparaat te brengen voor een
goede resolutie.
LM voor levende cellen
1) Fasecontrast-LM: faseverschuiving van licht +/- interferentie
(A) Gekleurde cel zal amplitude van
golflengtes van licht reduceren => kleurvorming
(B) Binnenin cel: verschil in optische dichtheid
=> faseverschuiving van golflengte van licht
wordt daarna herleid tot zwart wit beeld
Dit zal al een mooier beeld zijn dan klaarveld
2) Differentieel interferentie contrast microscoop: positieve/negatieve interferentie van
gepolariseerd licht, zie ook afbeelding hierboven met uitleg, mooier dan fasecontrast
3) Digitale microscoop
4) Fluorescentie microscoop = epifluoresecentie
Exitatielicht (licht met korte golflengte door filter te gebruiken) gebruiken dat valt op
materiaal waardoor het emissielicht (licht van een grotere golflengte) gaat uitzenden.
Ook moet op het preparaat fluorochrome stof worden aangebracht. Het is deze stof
die het emissielicht zal uitzenden op twee manieren:
- Conventioneel: vaak niet zo scherp want je bekijkt meerdere lagen
- Confocale laserscanning microscopie: veel scherper maar duurder want je bekijkt
maar 1 laag, dit doe je door gebruikt te maken van pin holes (sleutelgaten), gaat
meestal vrij traag tenzij gebruik wordt gemaakt van een spinning disk
