Inhoud
1. Cultuur specifieke celtypes.................................................................................................................. 2
2. Gespecialiseerde celsystemen ............................................................................................................ 7
3D culturen .......................................................................................................................................... 7
Spheroid culturen ............................................................................................................................ 8
Toepassingen ................................................................................................................................. 10
3. Stamcellen in cel-en weefselcultuur ................................................................................................. 12
Waarom werken met stamcellen? .................................................................................................... 12
Wat is een stamcel? .......................................................................................................................... 12
Stamcellen: classificatie..................................................................................................................... 13
Foetale stamcellen (-> hier wordt niet veel onderzoek meer naar gedaan) ................................ 13
Adulte stamcellen .......................................................................................................................... 14
Embryonale stamcellen ................................................................................................................. 14
Totipotente stamcellen ................................................................................................................. 15
Pluripotente stamcellen ................................................................................................................ 15
Multipotente stamcellen ............................................................................................................... 15
Stamcellen gebruikt in het biomedisch onderzoek: hESCs, SCNT-hESCs en iPSCs ............................ 16
1. hESCs ......................................................................................................................................... 16
2. SCNT-hESCs ................................................................................................................................ 26
3. iPSCs .......................................................................................................................................... 27
Artificiële embryo’s gemaakt uit stamcellen..................................................................................... 28
1. ‘Normale’ embryo ontwikkeling ................................................................................................ 28
2. Types van stamcellen: muis vs. mens ........................................................................................ 29
3. Artificiële muis embryo’s ........................................................................................................... 31
4. Artificiële humane embryo’s ..................................................................................................... 32
5. Artificiële gameten .................................................................................................................... 33
Andere klinische toepassingen van pluripotente stamcellen ........................................................... 34
1
,Les Björn Heindryckx
• TrypLE Express
o recombinant enzym zonder dierlijke oorsprong dat wordt gebruikt voor het
dissociëren van een breed scala aan adherente zoogdiercellen, waaronder CHO, HEK
293, A529, primaire humane keratinocyten en embryonale stamcellen
o splitst peptidebindingen op de C-terminale zijden van lysine en arginine en is een
directe vervanging voor trypsine
o de uitzonderlijke zuiverheid verhoogt de specificiteit en vermindert de schade aan
cellen die veroorzaakt kan worden door andere enzymen in sommige trypsine-
extracten
rProtease (trypsin-like protease, zeer stabiel en lage cel toxiciteit)
1. Cultuur specifieke celtypes
1. EPITHELIALE CELLEN
• Continue laag van cellen
• “Oppervlakte cellen” – overal in het lichaam
• Vormen barrière tussen “binnen” en “buiten”
• Functie: bescherming, secretie, absorptie en transport
• Morfologie (mono / multilaag) afhankelijk van functie
o Huid: meerlagig plaveisel EP
o Longen: 1-lagig plaveisel EP (naast barrière functie ook absorptie en transport)
o Nieren: 1 lagig kubisch EP (naast barrière functie ook secretie van bepaalde factoren)
• In vitro cultuur
o Sterke cel-cel interacties
o Polygonale vorm
o Groeien in eilandjes (B)
o Contact inhibitie: enkel cellen aan de rand prolifereren
2
,1.1 Keratinocyten
• Isolatie keratinocyten
o Opperhuid cellen (epidermis)
o Donor huid: bv plastische chirurgie
o Transport op ijs (4°C ) -> om degradatie te vermijden
o Hoe korter de tijd tussen donatie en isolatie - hogere slaag kans
o Dermis en epidermis scheiden
▪ Enzymatische dissociatie: trypsine (30 min, 37°C)
▪ Inhibitie met serum houdend medium (RPMI 1640 – lage Ca)
▪ Dermis en epidermis mechanisch scheiden (pincetten)
o Keratinocyten uit epidermis
▪ Epidermis verder “versnijden”
▪ Filtratie: grote stukken verwijderen
▪ Centrifugeren: cel pellet suspenderen in cultuur medium
o Cellen uitzaaien
▪ Op feeder layer
Of
▪ Groeifactor gesupplementeerd medium (keratinocyte serum-free medium
(KSFM))
➢ serum is meestal afkomstig van dierlijke oorsprong -> als je wilt
overgaan op klinische toepassingen wil je zo weinig mogelijk met
dierlijke producten werken !!!
• Proliferatie keratinocyten
o Sub-cultivatie in lage Ca- houdend medium
• Terminale differentiatie
o Verhoogde cel-cel interactie
o Meerdere lagen
• Transport voor kliniek (brandwonden)
o Enzymatisch losmaken van plastiek
o Overbrengen op steriel gaas
3
, - Veh = medium met lage Ca inhoud
→ verdere differentiatie tegengaan
+ proliferatie bevorderen
- als je voldoende cellen hebt breng
je deze over naar medium met hoge
Ca om terminale differentiatie te
induceren
➔ uiteindelijk heb je laagje met
terminaal gedifferentieerde
epitheliale cellen
4
1. Cultuur specifieke celtypes.................................................................................................................. 2
2. Gespecialiseerde celsystemen ............................................................................................................ 7
3D culturen .......................................................................................................................................... 7
Spheroid culturen ............................................................................................................................ 8
Toepassingen ................................................................................................................................. 10
3. Stamcellen in cel-en weefselcultuur ................................................................................................. 12
Waarom werken met stamcellen? .................................................................................................... 12
Wat is een stamcel? .......................................................................................................................... 12
Stamcellen: classificatie..................................................................................................................... 13
Foetale stamcellen (-> hier wordt niet veel onderzoek meer naar gedaan) ................................ 13
Adulte stamcellen .......................................................................................................................... 14
Embryonale stamcellen ................................................................................................................. 14
Totipotente stamcellen ................................................................................................................. 15
Pluripotente stamcellen ................................................................................................................ 15
Multipotente stamcellen ............................................................................................................... 15
Stamcellen gebruikt in het biomedisch onderzoek: hESCs, SCNT-hESCs en iPSCs ............................ 16
1. hESCs ......................................................................................................................................... 16
2. SCNT-hESCs ................................................................................................................................ 26
3. iPSCs .......................................................................................................................................... 27
Artificiële embryo’s gemaakt uit stamcellen..................................................................................... 28
1. ‘Normale’ embryo ontwikkeling ................................................................................................ 28
2. Types van stamcellen: muis vs. mens ........................................................................................ 29
3. Artificiële muis embryo’s ........................................................................................................... 31
4. Artificiële humane embryo’s ..................................................................................................... 32
5. Artificiële gameten .................................................................................................................... 33
Andere klinische toepassingen van pluripotente stamcellen ........................................................... 34
1
,Les Björn Heindryckx
• TrypLE Express
o recombinant enzym zonder dierlijke oorsprong dat wordt gebruikt voor het
dissociëren van een breed scala aan adherente zoogdiercellen, waaronder CHO, HEK
293, A529, primaire humane keratinocyten en embryonale stamcellen
o splitst peptidebindingen op de C-terminale zijden van lysine en arginine en is een
directe vervanging voor trypsine
o de uitzonderlijke zuiverheid verhoogt de specificiteit en vermindert de schade aan
cellen die veroorzaakt kan worden door andere enzymen in sommige trypsine-
extracten
rProtease (trypsin-like protease, zeer stabiel en lage cel toxiciteit)
1. Cultuur specifieke celtypes
1. EPITHELIALE CELLEN
• Continue laag van cellen
• “Oppervlakte cellen” – overal in het lichaam
• Vormen barrière tussen “binnen” en “buiten”
• Functie: bescherming, secretie, absorptie en transport
• Morfologie (mono / multilaag) afhankelijk van functie
o Huid: meerlagig plaveisel EP
o Longen: 1-lagig plaveisel EP (naast barrière functie ook absorptie en transport)
o Nieren: 1 lagig kubisch EP (naast barrière functie ook secretie van bepaalde factoren)
• In vitro cultuur
o Sterke cel-cel interacties
o Polygonale vorm
o Groeien in eilandjes (B)
o Contact inhibitie: enkel cellen aan de rand prolifereren
2
,1.1 Keratinocyten
• Isolatie keratinocyten
o Opperhuid cellen (epidermis)
o Donor huid: bv plastische chirurgie
o Transport op ijs (4°C ) -> om degradatie te vermijden
o Hoe korter de tijd tussen donatie en isolatie - hogere slaag kans
o Dermis en epidermis scheiden
▪ Enzymatische dissociatie: trypsine (30 min, 37°C)
▪ Inhibitie met serum houdend medium (RPMI 1640 – lage Ca)
▪ Dermis en epidermis mechanisch scheiden (pincetten)
o Keratinocyten uit epidermis
▪ Epidermis verder “versnijden”
▪ Filtratie: grote stukken verwijderen
▪ Centrifugeren: cel pellet suspenderen in cultuur medium
o Cellen uitzaaien
▪ Op feeder layer
Of
▪ Groeifactor gesupplementeerd medium (keratinocyte serum-free medium
(KSFM))
➢ serum is meestal afkomstig van dierlijke oorsprong -> als je wilt
overgaan op klinische toepassingen wil je zo weinig mogelijk met
dierlijke producten werken !!!
• Proliferatie keratinocyten
o Sub-cultivatie in lage Ca- houdend medium
• Terminale differentiatie
o Verhoogde cel-cel interactie
o Meerdere lagen
• Transport voor kliniek (brandwonden)
o Enzymatisch losmaken van plastiek
o Overbrengen op steriel gaas
3
, - Veh = medium met lage Ca inhoud
→ verdere differentiatie tegengaan
+ proliferatie bevorderen
- als je voldoende cellen hebt breng
je deze over naar medium met hoge
Ca om terminale differentiatie te
induceren
➔ uiteindelijk heb je laagje met
terminaal gedifferentieerde
epitheliale cellen
4
