fHoofdstuk 4: Immunohistochemische kleurtechniek (IHC), vervolg ..................................................... 2
4) Procedure immunohistochemische kleuring .................................................................................. 2
A) directe versus indirecte kleurmethode....................................................................................... 2
Directe methode ......................................................................................................................... 2
Indirecte methode ....................................................................................................................... 2
B) Verschillende merkersystemen................................................................................................... 4
B1) Immuno-enzymatische methode .......................................................................................... 4
B2) Immuno-fluorescentie methode ........................................................................................... 6
B3) Immuno-goud methode ........................................................................................................ 7
5) Controles bij immunokleuring ......................................................................................................... 9
6) Background kleuring........................................................................................................................ 9
A) Hydrofobe interacties ................................................................................................................. 9
B) Ionische (elektrostatische) interacties ...................................................................................... 10
C) Achtergrondkleuring tgv kruisreactiviteit AL ............................................................................ 10
7) Fixatie bij immunohistochemie ..................................................................................................... 10
A) Twee groepen van chemische fixatoren ................................................................................... 10
B) Fixatoren gebruikt bij IH voor LM ............................................................................................. 11
C) Fixatoren gebruikt bij IH voor EM (vb. immunogoud) .............................................................. 12
8) inbedden bij IH voor LM en EM..................................................................................................... 12
EXTRA: Flow cytometrie en celsortering (FACS) ................................................................................ 13
1
, Hoofdstuk 4: Immunohistochemische kleurtechniek (IHC), vervolg
4) Procedure immunohistochemische kleuring
1) Vorming van een AG-AL complex
2) Visualisatie van het AG-AL complex
Binden van merker aan antilichaam
• Verschillende merkersystemen: enzymen, fluorochromen, goudpartikels
• Directe en indirecte visualisatie of kleurmethode
A) directe versus indirecte kleurmethode
Directe methode
• Primair AL wordt gemerkt met signaalgenererende molecule
• Voor- en nadelen
o Snelle methode
o Beperkte niet-specifieke reacties
o Zwak signaal (geen amplificatie) → voor visualisatie van een abundant eiwit
o KOSTELIJK !!!
Indirecte methode
• 2 staps reactie
o Primair AL niet gemerkt; secundair AL gemerkt
Konijn-anti-muis AL gelabeld met Alexa 488
= secundair antilichaam opgewekt in konijn
dat muis antilichamen herkent
Muis-anti-humaan actine AL
= primair antilichaam opgewekt in muis dat
mens antigen herkent
2
4) Procedure immunohistochemische kleuring .................................................................................. 2
A) directe versus indirecte kleurmethode....................................................................................... 2
Directe methode ......................................................................................................................... 2
Indirecte methode ....................................................................................................................... 2
B) Verschillende merkersystemen................................................................................................... 4
B1) Immuno-enzymatische methode .......................................................................................... 4
B2) Immuno-fluorescentie methode ........................................................................................... 6
B3) Immuno-goud methode ........................................................................................................ 7
5) Controles bij immunokleuring ......................................................................................................... 9
6) Background kleuring........................................................................................................................ 9
A) Hydrofobe interacties ................................................................................................................. 9
B) Ionische (elektrostatische) interacties ...................................................................................... 10
C) Achtergrondkleuring tgv kruisreactiviteit AL ............................................................................ 10
7) Fixatie bij immunohistochemie ..................................................................................................... 10
A) Twee groepen van chemische fixatoren ................................................................................... 10
B) Fixatoren gebruikt bij IH voor LM ............................................................................................. 11
C) Fixatoren gebruikt bij IH voor EM (vb. immunogoud) .............................................................. 12
8) inbedden bij IH voor LM en EM..................................................................................................... 12
EXTRA: Flow cytometrie en celsortering (FACS) ................................................................................ 13
1
, Hoofdstuk 4: Immunohistochemische kleurtechniek (IHC), vervolg
4) Procedure immunohistochemische kleuring
1) Vorming van een AG-AL complex
2) Visualisatie van het AG-AL complex
Binden van merker aan antilichaam
• Verschillende merkersystemen: enzymen, fluorochromen, goudpartikels
• Directe en indirecte visualisatie of kleurmethode
A) directe versus indirecte kleurmethode
Directe methode
• Primair AL wordt gemerkt met signaalgenererende molecule
• Voor- en nadelen
o Snelle methode
o Beperkte niet-specifieke reacties
o Zwak signaal (geen amplificatie) → voor visualisatie van een abundant eiwit
o KOSTELIJK !!!
Indirecte methode
• 2 staps reactie
o Primair AL niet gemerkt; secundair AL gemerkt
Konijn-anti-muis AL gelabeld met Alexa 488
= secundair antilichaam opgewekt in konijn
dat muis antilichamen herkent
Muis-anti-humaan actine AL
= primair antilichaam opgewekt in muis dat
mens antigen herkent
2
