Hoofdstuk 2: preparatie van materiaal – kleuringen weefsel (cellen) .................................................... 2
A) Fixatie .............................................................................................................................................. 2
Chemische fixatie ............................................................................................................................ 2
Fixatie: formaldehyde.................................................................................................................. 2
Fixatie: glutaraldehyde ................................................................................................................ 2
Fixatie: osmiumtetroxide (OsO4) ................................................................................................ 3
Fixatieven gebruikt in routine LM vs fixatieven in routine EM ................................................... 3
Factoren die een rol spelen tijdens de fixatie ................................................................................. 3
Immersie fixatie – perfussie ............................................................................................................ 3
(Un)masking van een epitoop ......................................................................................................... 4
Fixatie artefacten: LM...................................................................................................................... 4
Fixatie artefacten: EM ..................................................................................................................... 4
B) Inbedden ......................................................................................................................................... 4
C) Snijden ......................................................................................................................................... 6
D) Kleuren – lichtmicroscopie ......................................................................................................... 7
Hematoxyline en eosine kleuring (H/E) ....................................................................................... 7
Kleuren van extracellulaire substanties ...................................................................................... 7
Kleuren van specifieke substanties ............................................................................................. 8
D) Contrasteren – elektronenmicroscopie ...................................................................................... 8
1
, Hoofdstuk 2: preparatie van materiaal – kleuringen weefsel (cellen)
Opeenvolgende stappen: fixeren, ontwateren, inbedden, snijden, kleuren/contrasteren
A) Fixatie
• Plots doden van weefsel met behoud van oorspronkelijke structuur → stilleggen van
bacteriële en autolytische afbraakreacties
• Permeabiliseren van celmembraan
• Harder en poreuzer maken van het weefsel
• ! Kleuring moet mogelijk blijven en verlies van kleine moleculen moet vermeden worden
• Hoe?
o Chemische fixatie: immersie of perfusie van het weefsel met een fixatief
(➔ denatureren van eiwitten)
o Fysische fixatie: bevriezen (morfologie blijft minder goed behouden)
Chemische fixatie
• Vernettende fixatieven (cross linkers)
o Bv. formaldehyde, glutaraldehyde, Oso4 (osmiumtetroxide)
• Precipiterende fixatieven
o Bv. alcohol, aceton
Fixatie: formaldehyde
• Een gas met de volgende formule:
• Beschikbaar onder de vorm van:
o formol (37-40% in een waterige oplossing)
o en para-formaldehyde (poeder)
• Formol bevat methanol (10%) om polymerisatie tegen te gaan
• Formaldehyde reageert met verschillende delen van eiwitten, o.a. met amines (NH2 )
(lysine), sulfidryl (SH) (cysteine)
• Veel gebruikt: neutrale gebufferde waterige oplossing (pH 7.2) die 2-5 % formaldehyde bevat
(PBS gebruik je het beste)
Best een vers fixatief !
Fixatie: glutaraldehyde
• Formule:
• Reageert eveneens met amino-groepen van eiwitten maar kan aan meerdere eiwitten
binden (betere cross-linker dan formaldehyde)
• Beter morfologie, vaak minder goed voor immunocytochemie (antilichamen kunnen niet aan
materiaal door te sterke vernetting)
2
A) Fixatie .............................................................................................................................................. 2
Chemische fixatie ............................................................................................................................ 2
Fixatie: formaldehyde.................................................................................................................. 2
Fixatie: glutaraldehyde ................................................................................................................ 2
Fixatie: osmiumtetroxide (OsO4) ................................................................................................ 3
Fixatieven gebruikt in routine LM vs fixatieven in routine EM ................................................... 3
Factoren die een rol spelen tijdens de fixatie ................................................................................. 3
Immersie fixatie – perfussie ............................................................................................................ 3
(Un)masking van een epitoop ......................................................................................................... 4
Fixatie artefacten: LM...................................................................................................................... 4
Fixatie artefacten: EM ..................................................................................................................... 4
B) Inbedden ......................................................................................................................................... 4
C) Snijden ......................................................................................................................................... 6
D) Kleuren – lichtmicroscopie ......................................................................................................... 7
Hematoxyline en eosine kleuring (H/E) ....................................................................................... 7
Kleuren van extracellulaire substanties ...................................................................................... 7
Kleuren van specifieke substanties ............................................................................................. 8
D) Contrasteren – elektronenmicroscopie ...................................................................................... 8
1
, Hoofdstuk 2: preparatie van materiaal – kleuringen weefsel (cellen)
Opeenvolgende stappen: fixeren, ontwateren, inbedden, snijden, kleuren/contrasteren
A) Fixatie
• Plots doden van weefsel met behoud van oorspronkelijke structuur → stilleggen van
bacteriële en autolytische afbraakreacties
• Permeabiliseren van celmembraan
• Harder en poreuzer maken van het weefsel
• ! Kleuring moet mogelijk blijven en verlies van kleine moleculen moet vermeden worden
• Hoe?
o Chemische fixatie: immersie of perfusie van het weefsel met een fixatief
(➔ denatureren van eiwitten)
o Fysische fixatie: bevriezen (morfologie blijft minder goed behouden)
Chemische fixatie
• Vernettende fixatieven (cross linkers)
o Bv. formaldehyde, glutaraldehyde, Oso4 (osmiumtetroxide)
• Precipiterende fixatieven
o Bv. alcohol, aceton
Fixatie: formaldehyde
• Een gas met de volgende formule:
• Beschikbaar onder de vorm van:
o formol (37-40% in een waterige oplossing)
o en para-formaldehyde (poeder)
• Formol bevat methanol (10%) om polymerisatie tegen te gaan
• Formaldehyde reageert met verschillende delen van eiwitten, o.a. met amines (NH2 )
(lysine), sulfidryl (SH) (cysteine)
• Veel gebruikt: neutrale gebufferde waterige oplossing (pH 7.2) die 2-5 % formaldehyde bevat
(PBS gebruik je het beste)
Best een vers fixatief !
Fixatie: glutaraldehyde
• Formule:
• Reageert eveneens met amino-groepen van eiwitten maar kan aan meerdere eiwitten
binden (betere cross-linker dan formaldehyde)
• Beter morfologie, vaak minder goed voor immunocytochemie (antilichamen kunnen niet aan
materiaal door te sterke vernetting)
2
