Gen- & celtechnologie
1. Recombinante DNA technologie
Gentechnologie = gericht aanpassen van genetische informatie door middel van klassieke kruisingsschema’s of
moleculair-biologische technieken
Genetic engineering = methode om de frequentie van een bepaald allel te
verhogen in de populatie
→ DNA van een andere organisme inbrengen ⇒ transgene organismen
→ sneller & betrouwbaarder
Recombinant DNA = DNA van verschillende oorsprong verbinden
Basismethoden:
● Isolatie of amplicatie van het gen
→ via PCR: 5’ naar 3’
→ primers, dNTPs, Mg2+ & polymerase
● Gen muteren
→ via overlap PCR: primers overlappen op de plaats van de mutatie
→ 2 verschillende PCR producten aan elkaar ligeren ⇒ nieuw PCR
product
● Kleine deletie:
A & D zullen het hele geamplificeerde gen
kopiëren
5’ van B is complementair aan 3’ van C
AB & CD aan elkaar binden
PCR met beide PCR producten ⇒ zullen
binden aan elkaar
→ primers A & D gebruiken
Alles tussen de rode stippellijnen is
verwijderd
● Grote deletie:
A & D omvatten het volledige gen (in
het begin & op het eind van de
sequentie)
B & C zijn combinaties, een stukje
hebben we nodig voor de amplificatie,
het andere stuk moet complementair zijn
aan de andere primer
Blauw is complementair aan geel
● Grote insertie
, B & C moeten nu complementair zijn
aan de primers die gebruikt worden
voor het te insereren DNA
3 PCRs: AB, CD & EF
● Gen kloneren
○ Klassieke cut & paste: restrictie enzymen
→ knippen op palindromische sequenties ⇒ sticky of blunt ends
→ om juiste richting te garanderen zijn 2 verschillende restrictie enzymes nodig
→ DNA ligase plakt
→ slechte efficiëntie dus goede cloning vector selecteren
→ transformeren in bacterie ⇒ opgroeien op selectief medium
○ TOPO cloning
→ topoisomerase I knipt & reassembleert dsDNA uiteinden
→ topo vector gemixt met PCR producten ⇒ TOPO enzymen ligeren het product in de vector
→ TOPO TA vectoren hebben 3’ T overhangsels die complementair zijn met 3’ A overhangsels van het PCR
product (door Taq polymerase)
○ Gateway cloning
→ site-specifieke recombinatie enzymen
→ uitwisseling tussen DNA helices van specifieke plaatsen op 2 verschillende moleculen
→ systeem uit bacteriofaag λ
,
BP reactie: tussen attB & attP sites ⇒ entry clone
De donor vector bevat een counterselectie gen
→ fataal voor E. Coli ⇒ overleeft enkel als BP reactie
gelukt is
LR reactie: tussen attL & attR sites ⇒ expression clone
→ incubatie met LR clonase & destinatie vector
→behandeling met proteïnase K ⇒ clonase kapot ⇒
reactie eindigt
→ irreversibel
Selecteren via ampicilline resistentie
○ Gibson assembly cloning
→ 3 opeenvolgende enzymatische activiteiten
→ 5’ exonuclease ⇒ 3’ overhangsels ⇒ annealing tussen complementaire
→ 3’ polymerase ⇒ vult de gaten in de sequentie
→ DNA ligase
→ veel sneller dan cut & paste + kan veel DNA fragmenten tegelijk cloneren
● Overbrengen in een plasmide
○ BACs = bacterial artificial chromosomes (tot 300 kbs)
○ YACs = yeast artificial chromosomes (tot 500 kbs)
○ Virale vectoren
■ adenovirale vectoren: naakt dsDNA virus
→ kunnen genoom niet in gastheergenoom integreren → transiënte expressie
→ hoge titers (kunnen toxisch zijn)
→ infectie van delende & senescente cellen
→ brede weefseltropisme
→ immunogeen
■ adeno-associated virus vectoren (AAV)
→ afhankelijk van helper virus voor replicatie ⇒ replicatie incompetent
→ geen integratie in het genoom maar vormen stabiele episomale structuren voor langdurige expressie
→ geen mutagenese
→ infectie van delende & senescente cellen
→ limiet op de grootte
→ lage titer & laag level van genexpressie
■ retrovirussen
→ integratie in het genoom ⇒ blijvend effect op het organisme
→ enkel bij delende cellen
■ lentivirussen: subfamilie van retrovirussen
→ kunnen gen van interesse introduceren in senescente cellen & delende cellen
→ pseudotyping: kapseleiwitten van invasievere virussen voor betere infectie van een breder spectrum
cellen
1. Recombinante DNA technologie
Gentechnologie = gericht aanpassen van genetische informatie door middel van klassieke kruisingsschema’s of
moleculair-biologische technieken
Genetic engineering = methode om de frequentie van een bepaald allel te
verhogen in de populatie
→ DNA van een andere organisme inbrengen ⇒ transgene organismen
→ sneller & betrouwbaarder
Recombinant DNA = DNA van verschillende oorsprong verbinden
Basismethoden:
● Isolatie of amplicatie van het gen
→ via PCR: 5’ naar 3’
→ primers, dNTPs, Mg2+ & polymerase
● Gen muteren
→ via overlap PCR: primers overlappen op de plaats van de mutatie
→ 2 verschillende PCR producten aan elkaar ligeren ⇒ nieuw PCR
product
● Kleine deletie:
A & D zullen het hele geamplificeerde gen
kopiëren
5’ van B is complementair aan 3’ van C
AB & CD aan elkaar binden
PCR met beide PCR producten ⇒ zullen
binden aan elkaar
→ primers A & D gebruiken
Alles tussen de rode stippellijnen is
verwijderd
● Grote deletie:
A & D omvatten het volledige gen (in
het begin & op het eind van de
sequentie)
B & C zijn combinaties, een stukje
hebben we nodig voor de amplificatie,
het andere stuk moet complementair zijn
aan de andere primer
Blauw is complementair aan geel
● Grote insertie
, B & C moeten nu complementair zijn
aan de primers die gebruikt worden
voor het te insereren DNA
3 PCRs: AB, CD & EF
● Gen kloneren
○ Klassieke cut & paste: restrictie enzymen
→ knippen op palindromische sequenties ⇒ sticky of blunt ends
→ om juiste richting te garanderen zijn 2 verschillende restrictie enzymes nodig
→ DNA ligase plakt
→ slechte efficiëntie dus goede cloning vector selecteren
→ transformeren in bacterie ⇒ opgroeien op selectief medium
○ TOPO cloning
→ topoisomerase I knipt & reassembleert dsDNA uiteinden
→ topo vector gemixt met PCR producten ⇒ TOPO enzymen ligeren het product in de vector
→ TOPO TA vectoren hebben 3’ T overhangsels die complementair zijn met 3’ A overhangsels van het PCR
product (door Taq polymerase)
○ Gateway cloning
→ site-specifieke recombinatie enzymen
→ uitwisseling tussen DNA helices van specifieke plaatsen op 2 verschillende moleculen
→ systeem uit bacteriofaag λ
,
BP reactie: tussen attB & attP sites ⇒ entry clone
De donor vector bevat een counterselectie gen
→ fataal voor E. Coli ⇒ overleeft enkel als BP reactie
gelukt is
LR reactie: tussen attL & attR sites ⇒ expression clone
→ incubatie met LR clonase & destinatie vector
→behandeling met proteïnase K ⇒ clonase kapot ⇒
reactie eindigt
→ irreversibel
Selecteren via ampicilline resistentie
○ Gibson assembly cloning
→ 3 opeenvolgende enzymatische activiteiten
→ 5’ exonuclease ⇒ 3’ overhangsels ⇒ annealing tussen complementaire
→ 3’ polymerase ⇒ vult de gaten in de sequentie
→ DNA ligase
→ veel sneller dan cut & paste + kan veel DNA fragmenten tegelijk cloneren
● Overbrengen in een plasmide
○ BACs = bacterial artificial chromosomes (tot 300 kbs)
○ YACs = yeast artificial chromosomes (tot 500 kbs)
○ Virale vectoren
■ adenovirale vectoren: naakt dsDNA virus
→ kunnen genoom niet in gastheergenoom integreren → transiënte expressie
→ hoge titers (kunnen toxisch zijn)
→ infectie van delende & senescente cellen
→ brede weefseltropisme
→ immunogeen
■ adeno-associated virus vectoren (AAV)
→ afhankelijk van helper virus voor replicatie ⇒ replicatie incompetent
→ geen integratie in het genoom maar vormen stabiele episomale structuren voor langdurige expressie
→ geen mutagenese
→ infectie van delende & senescente cellen
→ limiet op de grootte
→ lage titer & laag level van genexpressie
■ retrovirussen
→ integratie in het genoom ⇒ blijvend effect op het organisme
→ enkel bij delende cellen
■ lentivirussen: subfamilie van retrovirussen
→ kunnen gen van interesse introduceren in senescente cellen & delende cellen
→ pseudotyping: kapseleiwitten van invasievere virussen voor betere infectie van een breder spectrum
cellen
