Samenvatting HT2 over DNA manipulatie - farmaceutische biotechnologie

HOOFDSTUK 2: DNA MANIPULATIE

Plasmiden:

Welk DNA inbrengen in E.coli:
- Initieel: stukjes lineair DNA
o Meestal: DNA blijft in cytosol
 Slechts heel zelden integratie in het genoom
 Dus DNA niet doorgegeven aan dochtercellen
 E.coli: delen om de 2 uur
 Na 24 u: 1 à 212 = 4096
 Cellen zonder DNA >> met DNA
 Expresserende cellen gaan verloren
o Wat als je geen eiwit detecteert?
 Geen expressie of geen opname?
 DNA moet vermenigvuldigen en doorgegeven worden
Bacterieel DNA:
- 1 circulair chromosoom
o In cytosol
o Nucleoïde
 Chromosoom + RNA + aantal eiwitten
 Geen celmembraan
- Extrachromosomaal DNA, e.g. plasmide DNA:
o Dubbelstrengig, gesloten, circulair
o Van nature aanwezig in heel wat bacteriën (= gastheer)
 Knn maar overleven in beperkte set v sterk verwante bacteriën
 Kan doorgegeven worden bij deling of conjugatie
 Kan ook verloren gaan tijdens deling
o Bevat origin of replication  kan geamplificeerd worden door bacteriën
 Is afhankelijk vd enzymen en eiwitten vd gastheer
 Stabiel aantal per bacterie (‘copy number’)
o Natuurlijke functie:
 Bevatten genen die coderen voor enzymen voordelig voor gastheer
 Bv. antibiotica resistentie, afbraak complexe organische componenten,
productie toxines, restrictie enzymen*, …
Plasmiden – natuurlijke types:
- Relaxed vs. stringente plasmiden:
o Relaxed: Sommige plasmiden: tot 10-tallen per bacterie
o Stringent: Andere zeer stringent gereguleerd en maar paar/bacterie
- Conjugatieve vs. niet-conjugatieve plasmiden
o Conjugatieve plasmiden bevatten transfer genen die conjugatie tss bacteriën knn
veroorzaken  knn plasmiden doorgeven
- Over algemeen:
o Conjugatieve plasmiden groter en stringent plasmiden
o Niet-conjugatieve plasmiden kleiner en nt stringent
- Plasmide incompatibiliteit:
o Plasmiden v bepaalde incompatibiliteitsclasse knn nt tegelijk bestaan in bacterie met
plasmiden v andere incompatibiliteitsclasse

Essentieel hulpmiddel in biotechnologie:
- Onderzoekers knn ervoor zorgen dat bacteriën deze opnemen

, - Onderzoekers knn bacterie afh maken vh plasmide waardoor het nt verloren gaat
o Bv. Door het laten coderen ve antibioticum resistentie gen
- Bacterie zal plasmide talrijke keren kopiëren, + ook eventuele DNA dat door onderzoekers ih
plasmide gekloneerd werd
- Circulair
o Zaken in te kloneren want DNA valt nt uit elkaar als het open geknipt wordt
o Eens vreemd stukje toegevoegd  weer makkelijk geligeerd (=geplakt)
 Iets ligeren wordt ook ligatie genoemd
- Plasmiden aangepast door wetenschappers
- Essentiële elementen aanwezig in meeste plasmiden:
o Origin of replication (ori): plasmide geamplificeerd wordt in bacteriën
o Resistentiegen: onderscheiden bacteriën die plasmide al dan nt hebben opgenomen
o Multiple cloning site (MCS): regio waar vers. unieke restrictieplaatsen in voorkomen,
ligt nt in coderende regio  kan veilig geknipt worden om DNA toe te voegen
o …

Restrictie enzymen:

Oorsprong:

Jaartal Gebeurtenis
1950s Bacteriofagen knn beter groeien in sommige bacteriën dan andere
1960s Verminderde groei te wijten aan enzym dat specifiek bacteriofaag DNA knipt
1970 Opzuivering 1e restrictie enzym (HindII) en karakterisatie herkenningsseq + knip plaats
1970s REs knn gebruikt worden als hulpmiddelen in labo
1978 Nobelprijs voor fysiologie en geneeskunde
Restrictie enzymen = moleculaire scharen:
- Enzymen die bepaalde DNA seq herkennen en op specifieke plaats knippen in dsDNA
o Endonucleases  knippen nt aan uiteinde v DNA maar in midden
 Knippen in suiker-fosfaat ruggengraat vh DNA
 Hoofdketen in 2 geknipt, nt basen, DNA los v elkaar
o Dimere proteïnen, die palindromische seq herkennen (4 – 8 bp lang)
 Dimere proteïnen: 2 exacte kopiën eiwitten bij elkaar, elk eiwit dimeer
herkent 1 vd 2 strengen DNA
 Palindromische seq: 5’-GAGCTC-3’/ 3’- CTCGAG-5’
 Seq zowel forward streng als reverse zelfde (in 5’3’ richting)
 Herkenningsseq steeds aanwezig, dus eznym steeds knippen onafh v
welke DNA streng het enzym nadert
 Herkenningsseq in beide strengen dus beide geknipt
 Exogene DNA volledig doorgeknipt  herstel bemoeilijkt
- Naamgeving:
o Eerste letter: genus
o 2 volgende letters: species waaruit enzym eerst geïsoleerd werd
o Volgende letter: strain waaruit enzym eerst geïsoleerd werd
o Romeinse letter: volgorde waarop enzym geïsoleerd werd uit strain
o Bv. EcoRI komt van E.coli RY13