Analytische biochemie 2 | YS
Deel 2
Page 1 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
1. Inleiding 5
Elektromagnetische straling als golf 5
Elektromagnetische straling als energiequanta 5
Het elektromagnetisch spectrum 6
Molecuul- en atoomspectra 6
2. UV – VIS absorptiespectrofotometrie 8
Principe 8
Absorptiewetten 8
Foutenbronnen 9
Selectie van de golflengte voor concentratiebepalingen 9
Selectie van absorbantieniveau 10
3. Onderdelen van de spectrofotometer 10
De lichtbron 10
Monochromator 11
De monsterhouder 12
De detector 13
4. Configuratie van de spectrofotometer 14
Single-beam (eenstraals-) spectrofotometers 14
Double-beam (dubbelstraals-) spectrofotometers 15
5. Controle van de werking van een spectrofotometer 15
(1) Betrouwbaarheid van de golflengteschaal 15
(2) Accuraatheid van de gemeten absorptie 15
(3) Lineariteit van de absorptie in functie van de concentratie 15
(4) Aanwezigheid van strooilicht 16
6. Algemene werkwijze bij het uitwerken v/e UV-VIS-spectrofotometrische concentratiebepaling van een bepaalde (kleurloze)
substantie 16
7. Toepassingen: UV-VIS spectroscopie 16
1. Infrarood spectrometrie (IR) 17
Inleiding 17
Infrarood spectra: voorbeeld 17
2. Fluorimetrie 19
Fluorescentie-energie 19
Quantumefficiëntie 19
Opbouw van een fluorimeter 20
Excitatie- en emissiespectrum 20
Intensiteit van de fluorescentie 20
‘Quenching’ of fluorescentiedoving 21
Page 2 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
Toepassingen 21
3. Spectrometrische analyses obv lichtverstrooiing: turbidimetrie, nefelometrie, refractometrie 21
Turbidimetrie 22
Nefelometrie 22
Refractometrie 22
1. Nucleair magnetische resonantie spectrometrie (NMR): inleiding 23
Magnetische velden 23
Energieniveaus 23
NMR 23
2. Het 1H NMR spectrum 25
Voorbeeld: ethyl acetaat 25
1H NMR spectrum karakteristieken 25
Voorbeeld: opstellen piekpatroon van ethyl acetaat 28
3. 13C NMR spectra 28
Aantal signalen 28
Positie van de signalen 28
1. atoomspectrofotometrie 29
2. Atoomabsorptiespectrometrie (AAS) 29
Principe 29
De lichtbron 29
Atomaire absorptiespectrometrie met vlamatomisatie (FAAS): verstuiver-brandereenheid 31
Elektrothermische atomisatie (ETAAS): atomisatiebron 31
De monochromator 32
3. Atoomemissiespectrometrie met vlamatomisatie: vlamfotometrie 35
Algemeen 35
Configuratie 36
4. Inductief gekoppeld plasma (ICP-)spectrometrie 36
ICP-spectrometrie met optische detectie (ICP-AES) 36
ICP spectrometrie met massaspectrometrische detectie (ICP-MS) 37
5. Vergelijking technieken atomaire analyse 38
1. Inleiding 39
Configuratie en werking 39
2. Ionisatietechnieken 39
ESI (Electrospray Ionisation) 40
MADLI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) 40
SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption Ionisation) 40
Page 3 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
3. Massa analyse 41
Time of Flight (TOF) 41
Quadropole 41
3D-Ion Trap 41
4. Detector (Elektron multiplier) 42
5. Tandem massaspectrometrie 42
6. Massaspectrometrie: spectra 42
Voorbeeld: massaspectrum Aceton (MM 58) 42
Fragmentatie 43
Peptide fragmentatie 43
7. toepassingen 43
1. Morfologische analyse 44
Lichtmicroscopie 44
Configuratie van fasecontrast microscoop 44
Configuratie van de gepolariseerde licht microscoop 44
Elektronenmicroscopie 44
2. Biochemisch / enzymatische analyse 45
Analyse van AZ- en eiwitoplossingen: kwantificatie van AZ (colorimetrie) 45
Analyse van AZ- en eiwitoplossingen: kwantificatie van eiwitten 45
Analyse van AZ- en eiwitoplossingen: karakterisatie van eiwitten 48
Analyse van nucleotide- en nucleïnezuuroplossingen 50
Analyse van carbohydraatoplossingen 53
Analyse van lipiden 55
Bepalingsmethode: degradatie van lipiden 56
Bepalingsmethode: massaspectrometrie 57
Bepalingsmethode voor vetzuren 57
Bepalingsmethoden voor Sterolderivaten 58
Page 4 of 59
, Hoofdstuk 4.1: spectrometrische analysemthoden – UV – VIS biochemie 2 | YS
Analytische
1. INLEIDING
Elektromagnetische straling als golf
Elektromagnetische straling = propagerende golf met 2 loodrecht op elkaar staande golven (transversaal):
• Elektrische golf / veld
• Magnetische golf / veld
Elektromagnetische straling kan interageren met materie (atomaire en/of moleculaire stelsels)
Men kan golfverschijnsel omschrijven in termen van frequentie, golflengte, golfgetal, amplitude en snelheid.
RELEVANTE GOLFPARAMETERS IN DE ANALYTISCHE CHEMIE
1 Frequentie
Frequentie = hoevaak “iets” gebeurd binnen bepaalde tijd
= #trillingen thv bepaalde punt per seconde (Hz = 1 cyclus / sec)
Periode = tijd tussen 2 gebeurtenissen = tijd nodig om 1 cyclus te doorlopen
!
𝑣="
2 Golflengte
Golflengte (𝝀) = lineaire afstand tussen 2 opeenvolgende maxima / minima van een golf (nm in UV en VIS (zichtbaar), micrometer
in infrarood) – bij X-stralen: Angström (Å)
!
Golfgetal = (𝑐𝑚!" )
#
Product van stralingsfrequentie (trillingen/sec) * golflengte (cm/trillingscyclus) → voortplantingssnelheid straling (cm/sec):
𝑐
𝑣∗𝜆 =𝑐 ⟺𝜆 =
𝑣
Elektromagnetische straling als energiequanta
Straling beschouwen als verzameling energiepakketen (= fotonen) waarvan energie proportioneel is met stralingsfrequentie.
#
Formule van Planck: 𝐸 = ℎ ∗ 𝑣 = ℎ ∗ $
E = energie (J) – v = frequentie (Hz) – 𝜆 = golflengte (nm, 𝜇𝑚 of 𝐴̇) – c = lichtsnelheid – h = constante van Plank = 6,626 ∗
10!%& 𝐽 ∗ 𝑠𝑒𝑐
Energie van elektromagnetische straling is:
ð Recht evenredig met frequentie: hoe hoger v, hoe hoger energie
ð Omgekeerd evenredig met golflengte: hoe korter, hoe hoger energie
Page 5 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
Het elektromagnetisch spectrum
Gekleurde straling = het door het oog waarneembare gebied (zeer beperkt) – 380 nm tot 780 nm
INTERACTIE MET MATERIE
Afhankelijk van energie zullen er andere interacites zijn tussen de straling & materie:
• Spectrum zichtbaar licht: vooral buitenste 𝑒 ! interactie
• Als energie-inhoud krachtiger wordt (kortere golflengten) → ook binnenste 𝑒 ! geraakt door golflengte
• Bij langere golflengten worden 𝒆! spin / nucleaire spin beïnvloedt
Molecuul- en atoomspectra
BASISPRINCIPES VAN STRALINGSABSORPTIE
Absorptie gebeurt alleen als energie foton exact gelijk is aan energieverschil (Δ𝐸) tussen 2 toestanden van een atoom of molecuul.
→ Gequantiseerde energieovergangen = molecuul/atoom kan van energiestatus veranderen enkel wanneer ze foton ontvangt die
gepast overeenkomt met een van die overgangen
→ Δ𝐸 = ℎ ∗ 𝑣 = ℎ ∗ 𝑐/𝜆
Grondtoestand (S) = laagste energietoestand Aangeslagen toestand (E)* = hogere energietoestand (tijdelijk)
Drie soorten overgangen bij absorptie: 𝐸 ∗ → 𝑆 + ℎ∗ ∗ 𝑣
1) Rotatie-overgangen (ver IR): molecule kan roteren rond assen; toevoer energie → molecule sterker roteren
2) Vibratie-overgangen (nabij IR): atomen / atoomgroepen kunnen tov elkaar trillen
3) Elektron-overgangen (UV/VIS): 𝑒 ! in atoom / molecule kunnen naar meer energierijke orbitalen worden getransfereerd
→ Moleculen kunnen alleen overgaan naar hogere energietoestanden als fotonenergie precies overeenkomt met het verschil tussen
deze twee niveaus.
ENERGIENIVEAU DIAGRAM
A B C
Zuiver rotationele Combinatie rotationele & Elektron-overdracht met erop
veranderingen vibrationele transities gesuperponeerd vibratie &
rotatie transities
E2: elektronen grondtoestand
E1: elektronen aangeslagen toestand
Rotationele transities treden op bij lagere energie (grotere 𝜆). Deze energie is
onvoldoende om vibrationele transities en elektronen-overgangen te induceren gezien hogere energieën vereist zijn.
Page 6 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
ABSORPTIESPECTRA: LIJNSPECTRA VS. BANDENSPECTRA
Absorptie bandspectra van een aantal biologische moleculen
Moleculen kunnen verschillende energiën absorberen doordat ze: 𝑒 ! - dubbele bindingen – complexe structuren bevatten.
Energie-overgangen verlopen volgens deze volgorde:
1) Elektronen energieovergangen (UV-VIS)
2) Vibratie energietransities (nabij infrarood)
3) Rotatie-energieovergangen (ver infrarood)
In het UV-VIS bereik:
§ Molecuulspectra bestaan uit een elektronenspectrum met overlappende vibratie- en rotatie-overgangen
§ Dit resulteert in een breed bandspectrum ipv discrete lijnen → minder resolutie
Waarneembare kleur = complementaire kleur van geabsorbeerde licht
Continue spectrum: moleculen kunnen op elk moment verschillende energiepakketjes absorberen → vloeiend patroon
Lijnspectra van een aantal elementen (atomen)
Elk element heeft een uniek lijnspectrum door absorptie of emissie van fotonen → identificatie elementen
Atomen kunnen niet roteren of vibreren zoals moleculen (geen bindingen) → enkel elektronenovergangen mogelijk
Resultaat = discreet lijnenspectrum → absorptie enkel bij specifieke golflengten
EXCITATIE EN RELAXATIE
Aangeslagen toestanden (excitaties) zijn kortstondig (~10!( 𝑡𝑜𝑡 10!) sec ) – beëindigd door relaxatieprocessen
Bij terugval naar een lager energieniveau wordt de geabsorbeerde energie opnieuw uitgezonden als een foton
→ Energie voldoet aan: 𝐸 = ℎ ∗ 𝑣 = ℎ ∗ 𝑐/𝜆
Belangrijke vorm van relaxatie: emissie van straling, zoals: fluorescentie – fosforescentie
Page 7 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
2. UV – VIS ABSORPTIESPECTROFOTOMETRIE
Principe
Gebaseerd op het principe dat gekleurde verbindingen een deel van het invallende licht absorberen.
Hoe minder licht doorkomt (transmissie), hoe hoger de concentratie van absorberende stof.
Gebruikte elektromagnetische straling:
§ 180-400 nm: UV
§ 400-800: zichtbaar licht (VIS)
§ >800 nm: infrarood (IR)
EIGENSCHAPPEN VAN LICHT
Reflectie = licht weerkaatsen Absorptie = licht opnemen Transmissie = licht doorgelaten
COMPLEMENTAIRE KLEUREN
Wanneer een kleur geabsorbeerd wordt, dan zal de complementaire kleur waargenomen worden!
Absorptiewetten
WET VAN BOUGUER-LAMBERT
Beschrijft het verband tussen lichtabsorptie en de weglengte (𝑙) doorheen een absorberend medium
Transmissie (T) = verhouding doorgelaten tov invallend licht: 𝑇 = 𝐼/𝐼* 𝐼* = intensiteit invallend licht
Bij 0% doorgelaten licht: 𝑇 = 0, bij 100%: 𝑇 = 1 𝐼 = intensiteit na doorgang
!
Lichtintensiteit daalt exponentieel met toenemende weglengte: 𝑇 = = 𝑒 "#∗! of 𝐼 = 𝐼% ∗ 𝑒 "#∗!
!!
𝜀 = specifieke absorbtiecoëfficiënt (afhankelijk stof, lichtenergie en concentratie)
WET VAN BEER
Beer gerelateerde in reeks analoge experimenten transmissie met concentratie
" ∗&
De afname van transmissie was exponentioneel met toenemende concentratie: 𝑇 = 𝑒 "#
𝜀 + = empirische constante afhankelijk soort stof c = concentratie
WET VAN BOUGUER-LAMBERT EN BEER
! !
𝑇 = ! = 𝑒 "#∗!∗& 𝐿𝑜𝑔'% (𝑇) = log'% /! 0 = −𝜀 ∗ 𝐼 ∗ 𝑐 ∗ log'% (𝑒)
! !
Page 8 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
Om negatief teken weg te werken: absorbantie A (= exctinctie E of OD) ingevoerd
' !
𝐴 = − log 𝑇 = log ( = log ! = 𝜀 ∗ 𝐼 ∗ 𝑐
!
Log transformatie resulteert in lineaire vergelijking tussen absorbantie en concentratie van de absorberende substantie.
Opmerking: 𝜀 = specifieke absorptiecoëfficiënt (vroeger ook specifieke exctinctiecoëfficiënt genoemd)
§ Correspondeert met absorptie bij bepaalde 𝜆 gerealiseerd door oplossing met eenheidsconcentratie 1g/L bij
lichtweg 1 cm → 𝜀 uitgedrukt in 𝐿/𝑐𝑚 ∗ 𝑔
§ In geval concentratie mol/L → molaire absorptiecoëfficiënt (𝐿/𝑐𝑚 ∗ 𝑚𝑜𝑙)
Foutenbronnen
Metingen van 𝐼 en 𝐼* kunnen verstoord worden door:
➭ Reflectie, absorbtie of breking aan cuvetwand
➭ Lichtverstrooiing door grote moleculen of onzuiverheden in monster
Oplossing: ook meting uitvoeren met blanco-oplossing in een identieke cuvet → storingen gecorrigeerd
Selectie van de golflengte voor concentratiebepalingen
Opnemen van netto absorptiespectrum (monster – blanco) is nodig om de beste meetgolflengte te kiezen.
Netto = absorbantiespectrum van onbekende oplossing min van blanco-oplossing
Kies golflengte met maximale absorptie (𝜆,-. ) → hoogste 𝜀 geeft:
➭ Grootste verandering in absorbantie (∆𝐴) bij kleine concentratiewijziging (hoge gevoeligheid)
➭ Minste fout door golflengteschommelingen
Het spectrum kan ook helpen bij identificatie van chemische verbindingen.
Foutenbronnen: selectie golflengte
Wet van Lambert-Beer geldt enkel bij monochromatisch licht (1 golflengte, constante 𝜀)
→ In werkelijkheid wordt gemeten over een bandbreedte ∆𝝀 waarin 𝜀 kan variëren
→ Gevolg: afwijking lineariteit in de ijklijn (buiging)
Oplossing:
§ Kies bandbreedte met hoge intensiteit → 𝜀 blijft nagenoeg constant
§ Controleer altijd het lineaire bereik van absorptie versus concentratie
§ Kleine afwijkingen kunnen alsnog via ijklijn worden gecorrigeerd
§ Isobestisch punt gebruiken bij wisselende analytsamenstelling (associatie/dissociatie)
Page 9 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
Isobetisch punt
Polymerisatie of concentratiewijziging kan het absorptiespectrum doen verschuiven
→ 𝜀 ↗ bij 𝜆" , en 𝜀 ↘ bij 𝜆% , maar blijft constant bij 𝜆/ = isobestisch punt
Metingen bij isobestisch punt vermijden fouten door zule spectrale verschuivingen
Belangrijk:
➭ Controleer vooraf binnen welk concentratiegebied de Lambert-Beer nog lineair blijft
➭ Ook pH, solventpolariteit, naburige moleculen en conformatieveranderingen kunnen 𝜀 en 𝜆,-. beïnvloeden
Selectie van absorbantieniveau
• Te lage absorptie (A < 0,2): relatief grote meetfout door klein transmissieverschil
• Te hoge absorptie (A > 1,5): vereist zeer stabiel toestel door sterke signaalverzwakking
Ideaal bereik voor precieze metingen = absorptie tussen 0,2 – 0,7 A (transmissie 20-65%)
= minimaal risico op meetfouten (lage RSD (minimale relatieve fout))
3. ONDERDELEN VAN DE SPECTROFOTOMETER
Lichtbron: straal vereiste Monochromator: Cuvethouder
golflengtegebied uit ↦ Filtert smalle golflengteband uit volledig spectrum
↦ Filterfotometers: werken met vaste bandbreedte
↦ Spectrofotometers: prisma / roosters voor breder bereik
Lichtdetector: omzetting Versterker en uitlezing: versterkt signaal en geeft het weer op
tot elektrisch signaal scherm of registreersysteem
De lichtbron
Eigenschappen van een goede lichtbron:
Breed spectraalbereik Hoge intensiteit vanuit klein stralingsopp. Continu spectrum zonder scherpe pieken
Stabiele intensiteit Lange levensduur Lage kostprijs
Soorten lichtbronnen:
Wolfraamfilamentlamp Voor VIS en nabij IR (320-1000 nm)
Intensiteit stijgt met temperatuur → temperatuurstabiliteit belangrijk!
Wolfraam-halogeenlamp = ballon gevuld met jodium
Hogere temperatuur (tot 3000 K) → bereik tot 2500 nm
Page 10 of 59
Deel 2
Page 1 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
1. Inleiding 5
Elektromagnetische straling als golf 5
Elektromagnetische straling als energiequanta 5
Het elektromagnetisch spectrum 6
Molecuul- en atoomspectra 6
2. UV – VIS absorptiespectrofotometrie 8
Principe 8
Absorptiewetten 8
Foutenbronnen 9
Selectie van de golflengte voor concentratiebepalingen 9
Selectie van absorbantieniveau 10
3. Onderdelen van de spectrofotometer 10
De lichtbron 10
Monochromator 11
De monsterhouder 12
De detector 13
4. Configuratie van de spectrofotometer 14
Single-beam (eenstraals-) spectrofotometers 14
Double-beam (dubbelstraals-) spectrofotometers 15
5. Controle van de werking van een spectrofotometer 15
(1) Betrouwbaarheid van de golflengteschaal 15
(2) Accuraatheid van de gemeten absorptie 15
(3) Lineariteit van de absorptie in functie van de concentratie 15
(4) Aanwezigheid van strooilicht 16
6. Algemene werkwijze bij het uitwerken v/e UV-VIS-spectrofotometrische concentratiebepaling van een bepaalde (kleurloze)
substantie 16
7. Toepassingen: UV-VIS spectroscopie 16
1. Infrarood spectrometrie (IR) 17
Inleiding 17
Infrarood spectra: voorbeeld 17
2. Fluorimetrie 19
Fluorescentie-energie 19
Quantumefficiëntie 19
Opbouw van een fluorimeter 20
Excitatie- en emissiespectrum 20
Intensiteit van de fluorescentie 20
‘Quenching’ of fluorescentiedoving 21
Page 2 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
Toepassingen 21
3. Spectrometrische analyses obv lichtverstrooiing: turbidimetrie, nefelometrie, refractometrie 21
Turbidimetrie 22
Nefelometrie 22
Refractometrie 22
1. Nucleair magnetische resonantie spectrometrie (NMR): inleiding 23
Magnetische velden 23
Energieniveaus 23
NMR 23
2. Het 1H NMR spectrum 25
Voorbeeld: ethyl acetaat 25
1H NMR spectrum karakteristieken 25
Voorbeeld: opstellen piekpatroon van ethyl acetaat 28
3. 13C NMR spectra 28
Aantal signalen 28
Positie van de signalen 28
1. atoomspectrofotometrie 29
2. Atoomabsorptiespectrometrie (AAS) 29
Principe 29
De lichtbron 29
Atomaire absorptiespectrometrie met vlamatomisatie (FAAS): verstuiver-brandereenheid 31
Elektrothermische atomisatie (ETAAS): atomisatiebron 31
De monochromator 32
3. Atoomemissiespectrometrie met vlamatomisatie: vlamfotometrie 35
Algemeen 35
Configuratie 36
4. Inductief gekoppeld plasma (ICP-)spectrometrie 36
ICP-spectrometrie met optische detectie (ICP-AES) 36
ICP spectrometrie met massaspectrometrische detectie (ICP-MS) 37
5. Vergelijking technieken atomaire analyse 38
1. Inleiding 39
Configuratie en werking 39
2. Ionisatietechnieken 39
ESI (Electrospray Ionisation) 40
MADLI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation) 40
SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption Ionisation) 40
Page 3 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
3. Massa analyse 41
Time of Flight (TOF) 41
Quadropole 41
3D-Ion Trap 41
4. Detector (Elektron multiplier) 42
5. Tandem massaspectrometrie 42
6. Massaspectrometrie: spectra 42
Voorbeeld: massaspectrum Aceton (MM 58) 42
Fragmentatie 43
Peptide fragmentatie 43
7. toepassingen 43
1. Morfologische analyse 44
Lichtmicroscopie 44
Configuratie van fasecontrast microscoop 44
Configuratie van de gepolariseerde licht microscoop 44
Elektronenmicroscopie 44
2. Biochemisch / enzymatische analyse 45
Analyse van AZ- en eiwitoplossingen: kwantificatie van AZ (colorimetrie) 45
Analyse van AZ- en eiwitoplossingen: kwantificatie van eiwitten 45
Analyse van AZ- en eiwitoplossingen: karakterisatie van eiwitten 48
Analyse van nucleotide- en nucleïnezuuroplossingen 50
Analyse van carbohydraatoplossingen 53
Analyse van lipiden 55
Bepalingsmethode: degradatie van lipiden 56
Bepalingsmethode: massaspectrometrie 57
Bepalingsmethode voor vetzuren 57
Bepalingsmethoden voor Sterolderivaten 58
Page 4 of 59
, Hoofdstuk 4.1: spectrometrische analysemthoden – UV – VIS biochemie 2 | YS
Analytische
1. INLEIDING
Elektromagnetische straling als golf
Elektromagnetische straling = propagerende golf met 2 loodrecht op elkaar staande golven (transversaal):
• Elektrische golf / veld
• Magnetische golf / veld
Elektromagnetische straling kan interageren met materie (atomaire en/of moleculaire stelsels)
Men kan golfverschijnsel omschrijven in termen van frequentie, golflengte, golfgetal, amplitude en snelheid.
RELEVANTE GOLFPARAMETERS IN DE ANALYTISCHE CHEMIE
1 Frequentie
Frequentie = hoevaak “iets” gebeurd binnen bepaalde tijd
= #trillingen thv bepaalde punt per seconde (Hz = 1 cyclus / sec)
Periode = tijd tussen 2 gebeurtenissen = tijd nodig om 1 cyclus te doorlopen
!
𝑣="
2 Golflengte
Golflengte (𝝀) = lineaire afstand tussen 2 opeenvolgende maxima / minima van een golf (nm in UV en VIS (zichtbaar), micrometer
in infrarood) – bij X-stralen: Angström (Å)
!
Golfgetal = (𝑐𝑚!" )
#
Product van stralingsfrequentie (trillingen/sec) * golflengte (cm/trillingscyclus) → voortplantingssnelheid straling (cm/sec):
𝑐
𝑣∗𝜆 =𝑐 ⟺𝜆 =
𝑣
Elektromagnetische straling als energiequanta
Straling beschouwen als verzameling energiepakketen (= fotonen) waarvan energie proportioneel is met stralingsfrequentie.
#
Formule van Planck: 𝐸 = ℎ ∗ 𝑣 = ℎ ∗ $
E = energie (J) – v = frequentie (Hz) – 𝜆 = golflengte (nm, 𝜇𝑚 of 𝐴̇) – c = lichtsnelheid – h = constante van Plank = 6,626 ∗
10!%& 𝐽 ∗ 𝑠𝑒𝑐
Energie van elektromagnetische straling is:
ð Recht evenredig met frequentie: hoe hoger v, hoe hoger energie
ð Omgekeerd evenredig met golflengte: hoe korter, hoe hoger energie
Page 5 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
Het elektromagnetisch spectrum
Gekleurde straling = het door het oog waarneembare gebied (zeer beperkt) – 380 nm tot 780 nm
INTERACTIE MET MATERIE
Afhankelijk van energie zullen er andere interacites zijn tussen de straling & materie:
• Spectrum zichtbaar licht: vooral buitenste 𝑒 ! interactie
• Als energie-inhoud krachtiger wordt (kortere golflengten) → ook binnenste 𝑒 ! geraakt door golflengte
• Bij langere golflengten worden 𝒆! spin / nucleaire spin beïnvloedt
Molecuul- en atoomspectra
BASISPRINCIPES VAN STRALINGSABSORPTIE
Absorptie gebeurt alleen als energie foton exact gelijk is aan energieverschil (Δ𝐸) tussen 2 toestanden van een atoom of molecuul.
→ Gequantiseerde energieovergangen = molecuul/atoom kan van energiestatus veranderen enkel wanneer ze foton ontvangt die
gepast overeenkomt met een van die overgangen
→ Δ𝐸 = ℎ ∗ 𝑣 = ℎ ∗ 𝑐/𝜆
Grondtoestand (S) = laagste energietoestand Aangeslagen toestand (E)* = hogere energietoestand (tijdelijk)
Drie soorten overgangen bij absorptie: 𝐸 ∗ → 𝑆 + ℎ∗ ∗ 𝑣
1) Rotatie-overgangen (ver IR): molecule kan roteren rond assen; toevoer energie → molecule sterker roteren
2) Vibratie-overgangen (nabij IR): atomen / atoomgroepen kunnen tov elkaar trillen
3) Elektron-overgangen (UV/VIS): 𝑒 ! in atoom / molecule kunnen naar meer energierijke orbitalen worden getransfereerd
→ Moleculen kunnen alleen overgaan naar hogere energietoestanden als fotonenergie precies overeenkomt met het verschil tussen
deze twee niveaus.
ENERGIENIVEAU DIAGRAM
A B C
Zuiver rotationele Combinatie rotationele & Elektron-overdracht met erop
veranderingen vibrationele transities gesuperponeerd vibratie &
rotatie transities
E2: elektronen grondtoestand
E1: elektronen aangeslagen toestand
Rotationele transities treden op bij lagere energie (grotere 𝜆). Deze energie is
onvoldoende om vibrationele transities en elektronen-overgangen te induceren gezien hogere energieën vereist zijn.
Page 6 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
ABSORPTIESPECTRA: LIJNSPECTRA VS. BANDENSPECTRA
Absorptie bandspectra van een aantal biologische moleculen
Moleculen kunnen verschillende energiën absorberen doordat ze: 𝑒 ! - dubbele bindingen – complexe structuren bevatten.
Energie-overgangen verlopen volgens deze volgorde:
1) Elektronen energieovergangen (UV-VIS)
2) Vibratie energietransities (nabij infrarood)
3) Rotatie-energieovergangen (ver infrarood)
In het UV-VIS bereik:
§ Molecuulspectra bestaan uit een elektronenspectrum met overlappende vibratie- en rotatie-overgangen
§ Dit resulteert in een breed bandspectrum ipv discrete lijnen → minder resolutie
Waarneembare kleur = complementaire kleur van geabsorbeerde licht
Continue spectrum: moleculen kunnen op elk moment verschillende energiepakketjes absorberen → vloeiend patroon
Lijnspectra van een aantal elementen (atomen)
Elk element heeft een uniek lijnspectrum door absorptie of emissie van fotonen → identificatie elementen
Atomen kunnen niet roteren of vibreren zoals moleculen (geen bindingen) → enkel elektronenovergangen mogelijk
Resultaat = discreet lijnenspectrum → absorptie enkel bij specifieke golflengten
EXCITATIE EN RELAXATIE
Aangeslagen toestanden (excitaties) zijn kortstondig (~10!( 𝑡𝑜𝑡 10!) sec ) – beëindigd door relaxatieprocessen
Bij terugval naar een lager energieniveau wordt de geabsorbeerde energie opnieuw uitgezonden als een foton
→ Energie voldoet aan: 𝐸 = ℎ ∗ 𝑣 = ℎ ∗ 𝑐/𝜆
Belangrijke vorm van relaxatie: emissie van straling, zoals: fluorescentie – fosforescentie
Page 7 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
2. UV – VIS ABSORPTIESPECTROFOTOMETRIE
Principe
Gebaseerd op het principe dat gekleurde verbindingen een deel van het invallende licht absorberen.
Hoe minder licht doorkomt (transmissie), hoe hoger de concentratie van absorberende stof.
Gebruikte elektromagnetische straling:
§ 180-400 nm: UV
§ 400-800: zichtbaar licht (VIS)
§ >800 nm: infrarood (IR)
EIGENSCHAPPEN VAN LICHT
Reflectie = licht weerkaatsen Absorptie = licht opnemen Transmissie = licht doorgelaten
COMPLEMENTAIRE KLEUREN
Wanneer een kleur geabsorbeerd wordt, dan zal de complementaire kleur waargenomen worden!
Absorptiewetten
WET VAN BOUGUER-LAMBERT
Beschrijft het verband tussen lichtabsorptie en de weglengte (𝑙) doorheen een absorberend medium
Transmissie (T) = verhouding doorgelaten tov invallend licht: 𝑇 = 𝐼/𝐼* 𝐼* = intensiteit invallend licht
Bij 0% doorgelaten licht: 𝑇 = 0, bij 100%: 𝑇 = 1 𝐼 = intensiteit na doorgang
!
Lichtintensiteit daalt exponentieel met toenemende weglengte: 𝑇 = = 𝑒 "#∗! of 𝐼 = 𝐼% ∗ 𝑒 "#∗!
!!
𝜀 = specifieke absorbtiecoëfficiënt (afhankelijk stof, lichtenergie en concentratie)
WET VAN BEER
Beer gerelateerde in reeks analoge experimenten transmissie met concentratie
" ∗&
De afname van transmissie was exponentioneel met toenemende concentratie: 𝑇 = 𝑒 "#
𝜀 + = empirische constante afhankelijk soort stof c = concentratie
WET VAN BOUGUER-LAMBERT EN BEER
! !
𝑇 = ! = 𝑒 "#∗!∗& 𝐿𝑜𝑔'% (𝑇) = log'% /! 0 = −𝜀 ∗ 𝐼 ∗ 𝑐 ∗ log'% (𝑒)
! !
Page 8 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
Om negatief teken weg te werken: absorbantie A (= exctinctie E of OD) ingevoerd
' !
𝐴 = − log 𝑇 = log ( = log ! = 𝜀 ∗ 𝐼 ∗ 𝑐
!
Log transformatie resulteert in lineaire vergelijking tussen absorbantie en concentratie van de absorberende substantie.
Opmerking: 𝜀 = specifieke absorptiecoëfficiënt (vroeger ook specifieke exctinctiecoëfficiënt genoemd)
§ Correspondeert met absorptie bij bepaalde 𝜆 gerealiseerd door oplossing met eenheidsconcentratie 1g/L bij
lichtweg 1 cm → 𝜀 uitgedrukt in 𝐿/𝑐𝑚 ∗ 𝑔
§ In geval concentratie mol/L → molaire absorptiecoëfficiënt (𝐿/𝑐𝑚 ∗ 𝑚𝑜𝑙)
Foutenbronnen
Metingen van 𝐼 en 𝐼* kunnen verstoord worden door:
➭ Reflectie, absorbtie of breking aan cuvetwand
➭ Lichtverstrooiing door grote moleculen of onzuiverheden in monster
Oplossing: ook meting uitvoeren met blanco-oplossing in een identieke cuvet → storingen gecorrigeerd
Selectie van de golflengte voor concentratiebepalingen
Opnemen van netto absorptiespectrum (monster – blanco) is nodig om de beste meetgolflengte te kiezen.
Netto = absorbantiespectrum van onbekende oplossing min van blanco-oplossing
Kies golflengte met maximale absorptie (𝜆,-. ) → hoogste 𝜀 geeft:
➭ Grootste verandering in absorbantie (∆𝐴) bij kleine concentratiewijziging (hoge gevoeligheid)
➭ Minste fout door golflengteschommelingen
Het spectrum kan ook helpen bij identificatie van chemische verbindingen.
Foutenbronnen: selectie golflengte
Wet van Lambert-Beer geldt enkel bij monochromatisch licht (1 golflengte, constante 𝜀)
→ In werkelijkheid wordt gemeten over een bandbreedte ∆𝝀 waarin 𝜀 kan variëren
→ Gevolg: afwijking lineariteit in de ijklijn (buiging)
Oplossing:
§ Kies bandbreedte met hoge intensiteit → 𝜀 blijft nagenoeg constant
§ Controleer altijd het lineaire bereik van absorptie versus concentratie
§ Kleine afwijkingen kunnen alsnog via ijklijn worden gecorrigeerd
§ Isobestisch punt gebruiken bij wisselende analytsamenstelling (associatie/dissociatie)
Page 9 of 59
, Analytische biochemie 2 | YS
Isobetisch punt
Polymerisatie of concentratiewijziging kan het absorptiespectrum doen verschuiven
→ 𝜀 ↗ bij 𝜆" , en 𝜀 ↘ bij 𝜆% , maar blijft constant bij 𝜆/ = isobestisch punt
Metingen bij isobestisch punt vermijden fouten door zule spectrale verschuivingen
Belangrijk:
➭ Controleer vooraf binnen welk concentratiegebied de Lambert-Beer nog lineair blijft
➭ Ook pH, solventpolariteit, naburige moleculen en conformatieveranderingen kunnen 𝜀 en 𝜆,-. beïnvloeden
Selectie van absorbantieniveau
• Te lage absorptie (A < 0,2): relatief grote meetfout door klein transmissieverschil
• Te hoge absorptie (A > 1,5): vereist zeer stabiel toestel door sterke signaalverzwakking
Ideaal bereik voor precieze metingen = absorptie tussen 0,2 – 0,7 A (transmissie 20-65%)
= minimaal risico op meetfouten (lage RSD (minimale relatieve fout))
3. ONDERDELEN VAN DE SPECTROFOTOMETER
Lichtbron: straal vereiste Monochromator: Cuvethouder
golflengtegebied uit ↦ Filtert smalle golflengteband uit volledig spectrum
↦ Filterfotometers: werken met vaste bandbreedte
↦ Spectrofotometers: prisma / roosters voor breder bereik
Lichtdetector: omzetting Versterker en uitlezing: versterkt signaal en geeft het weer op
tot elektrisch signaal scherm of registreersysteem
De lichtbron
Eigenschappen van een goede lichtbron:
Breed spectraalbereik Hoge intensiteit vanuit klein stralingsopp. Continu spectrum zonder scherpe pieken
Stabiele intensiteit Lange levensduur Lage kostprijs
Soorten lichtbronnen:
Wolfraamfilamentlamp Voor VIS en nabij IR (320-1000 nm)
Intensiteit stijgt met temperatuur → temperatuurstabiliteit belangrijk!
Wolfraam-halogeenlamp = ballon gevuld met jodium
Hogere temperatuur (tot 3000 K) → bereik tot 2500 nm
Page 10 of 59
