Deel 1
, Analytische biochemie 2 | YS
1. Analytische performantie 3
Aard van de analyse 3
Selectiviteit en specificiteit 3
Gevoeligheid (sensititiveit) 3
Blancobepaling 3
Detectielimiet en kwantificatielimiet 4
Accuraatheid 4
Precisie 5
Accuraatheid en precisie 5
Concentratie van een bestanddeel, SD (standaardeviatie) en VC (variatiecoëfficiënt 5
LOD, LOQ, LOL en dynamisch bereik 6
2. KWaliteitscontrole van de biochemische analyse 6
Control charts 6
Kwaliteitscontrole: extern – voorbeeld 7
3. Kalibratie van biochemische analyse 7
Kalibratie van de analysemethode 7
4. Verschillende fasen van biochemische analyse 11
Definiëren van het analyseprobleem 11
Monstername 11
Voorbereiden van het monster 11
Procedures voor eliminatie van interferenties of aanrijking van de concentratie 11
5. Fouten in kwantitatieve analyse 12
Twee types fouten 12
Resultaten verwerpen (outliers) 12
1. Inleiding 13
Radioactiviteit: atoomstructuur 13
Radioactiviteit: atomaire stabiliteit en straling 13
Radioactiviteit 14
2. Detectie en meting van radioactiviteit 15
Radioactiviteit: interactie van radioactiviteit met materie 15
Detectie en meting radioactiviteit: gasionisatie 17
Detectie en meting van radioactiviteit: excitatie 17
3. Biologische effecten 21
4. Toepassingen in de biologie / biochemie 21
Onderzoek van metabolisme 21
Analytische toepassing 21
Page 1 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
1. Inleiding 23
De elektrochemie is essentieel gebasseerd op drie betrekkingen 23
Elektrolytoplossingen, elektrolyse en elektrochemische cellen 24
2. POtentiaalverschil tussen metaal en oplossing (zonder een opgelegd extern potentiaalverschil) 26
De elektrodepotentiaal 26
Standaard elektrodepotentiaal 27
Betrekking van Nernst voor… 28
3. Elektrochemische cellen 29
De galvanische cel 29
De elektrolysecel 30
4. Analytische methoden gebaseerd op elektrochemische bepalingen 30
5. Biosensoren 40
Biosensoren: concept 40
Biosensoren: enzyme-gebaseerde biosensoren met amperometrische detectie 40
Biosensoren: enzym-gebaseerde potentiometrische biosensoren 41
Page 2 of 41
, Hoofdstuk 1: analytische performantie, kwaliteitscontrole enAnalytische
kalibratie biochemie 2 | YS
1. ANALYTISCHE PERFORMANTIE
Aard van de analyse
Kwalitatieve analyse = toont aanwezigheid / afwezigheid van 1 of meerdere componenten.
Kwantitatieve analyse = meet de hoeveelheid van 1 of meerdere componenten.
• Individuele analyse: 1 specifieke stof (bv glucose)
• Groepsanalyse: meerdere verwante stoffen (bv totaal eiwitgehalte)
Alle analyses meten een fysische of fysio-chemische grootheid die (on)rechtstreeks evenredig is met de hoeveelheid te
doseren bestanddeel: massa, volume, stroomsterkte, …
Selectiviteit en specificiteit
Selectiviteit = test geeft voorkeur voor een bepaalde stof, maar kan ook reageren op andere stoffen.
Specificiteit = test reageert enkel op de gewenste stof → verbeterbaar via pH, temperatuur, complexvorming, eliminatie
storende factoren, …
Finaal dient de ideale test 100% specifiek te zijn = het geregistreerde signaal is enkel en alleen afkomstig van het analyt.
Gevoeligheid (sensititiveit)
Gevoeligheid = helling van ijkcurve = gemeten signaal / concentratie = signaal
per concentratie-eenheid.
ð Niet altijd hoge gevoeligheid nodig (afhankelijk van analyt)
Karakteristieke concentratie = hoeveelheid (𝜇𝑔 = 10!" 𝑔) van de te bepalen
stof die een absorbantie van 0,0044 (= 1% absorptie) teweegbrengt.
ð Uitgedrukt als 𝜇𝑔/𝑚𝐿/𝐼% 𝑎𝑏𝑠 of 𝜇𝑔/𝑔/𝐼% 𝑎𝑏𝑠
ð Gepubliceerde gevoeligheidswaarden = uitstekende referentie voor afstellen + kalibreren apparatuur en/of
controleren of de analyse betrouwbaar is
Blancobepaling
= achtergrondsignaal (background) = bepaling van de fractie vh totaalsignaal die niet te wijten is aan het te doseren
bestanddeel in het te analyseren staal.
Bijvoorbeeld: in spectrofotometrie: absorptie (= signaal) bijdrage solvent + reagentia – solvent kan ook licht absorberen
dus correctie nodig door absorptie te meten van solvent alleen (= background) en af te trekken vd signalen vd stalen.
Page 3 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
Detectielimiet en kwantificatielimiet
LOD (limit of detection) = minimaal meetbare concentratie → 2x achtergrondsignaal of 3x SD (= standaarddeviatie) van
blank signaal.
= concentratie die signaal / ruis verhouding van 2 veroorzaakt (S/N = signal-to-noise ratio)
↳ Kwalitatieve bepalingen
LOQ (limit of quantification) = laagste concentratie die kwantitatief kan worden bepaald → 10x SD van blank signaal
↳ Kwantitatieve bepalingen
LOD ≠ gevoeligheid !
ILLUSTRATIEF VOORBEELD
Gevoeligheid (sensitiviteit) is hetzelfde want beide methoden hebben een gemiddelde rond dezelfde hoogte.
Detectielimiet is hoger bij methode A omdat er meer variatie zit in het signaal → bij lagere concentratie al detectielimiet
vaststellen.
Accuraatheid
= maat voor afwijking van experimenteel gevonden analyseresultaat tov onbekende werkelijke waarde
= hoe dicht meetresultaat bij werkelijke waarde ligt.
ð Men stelt bepaalde eisen voor accuraatheid waarmee analyseresultaat dient gekendt te zijn: bv max. afwijking van
5%
ð Om accuraatheid van methode te bepalen → baseren op analyseren van “met certificaat voorziende”
standaardmonsters van erkende instituten
↳ Bv: National Bureau of Standars and Technology (USA) – British Standard Institute – National Institute of Health
(USA) – Community Bureau of Reference
Page 4 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
Precisie
= maat voor preproduceerbaarheid van de analyseresultaten.
Intra-run = reproduceerbaarheid binnen één analyse; gemiddelde afwijking tov gemiddelde tijdens 1 run i.e. onder
dezelfde condities (= within-run precision of repeatability)
↳ Bv: 10x achter elkaar meten
Inter-run = reproduceerbaarheid over verschillende runs; gemiddelde afwijking tov gemiddelde bij verschillende runs
onder veranderde conditites (= between-run precision of reproducibility)
↳ Bv: elke maandag
!"#$%##&%%'()#")' (!,)(#$ ('&./0)11'$%' 2'")$3'$ (#$ 0'"4'15%' ."##1 !,
Variatiecoëfficiënt (VC) = =
6'2)%%'1%' 7##&%' (8) (#$ ('&./0)11'$%' 2'")$3'$ (#$ 0'"4 15%' ."##1 8
ð Lage VC = hoge precisie
ð Accuraatheid ≠ precisie (je kan precies zijn, maar foutief)
Accuraatheid en precisie
Gemiddelde vd metingen ligt in rode Metingen liggen dichtbij elkaar (= Metingen zijn precies (liggen dichtbij
bol (= accuraat), maar waarde liggen precies), maar gemiddelde ligt niet in elkaar) en accuraat (gemiddelde ligt
ver van elkaar (= niet precies) rode bol (= niet accuraat) in rode bol)
Concentratie van een bestanddeel, SD (standaardeviatie) en VC (variatiecoëfficiënt
• SD blijft gelijk over • SD stijgt met concentratie, in • SD daalt mee met concentreatie,
concentratiebereik verhouding tot gemiddelde maar stopt op bepaalde punt
• Bij lage concentraties is VC hoog, • VC blijft gelijk → precisie is stabiel • Bij zeer lage concentraties stijgt
omdat spreiding groot is tov over hele meetgebied VC opnieuw, omdat SD relatief
gemiddelde groot blijft
Page 5 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
SD (standaarddeviatie) = absolute maat voor de spreiding van de meetresultaten
VC (variatiecoëfficiënt) = relatieve maat = SD gedeeld door gemiddelde, in % uitgedrukt
↳ Geeft de precisie aan: hoe lager VC, hoe beter precisie
Precisie (VC) is vaak concentratie-afhankelijk → daarom moet je precies bepalen bij meerdere concentraties, niet slechts
bij één.
LOD, LOQ, LOL en dynamisch bereik
LOD = limit of detection → 2x achtergrond of 3x SD van
achtergrondsignaal
LOQ = limit of quantification → 10x SD van achtergrondsignaal
LOL = limit of linearity = hoogste concenteatie waarbij lineair
verband nog geldt → lineair verloopt grafiek stopt
Helling = gevoeligheid (sensitiviteit)
Achtergrond ruis wordt afgetrokken van gemeten signaal
Dynamisch bereik ligt tussen LOQ en LOL = bereik waarin we kwantificatie kunnen uitvoeren → hierin metingen uitvoeren
2. KWALITEITSCONTROLE VAN DE BIOCHEMISCHE ANALYSE
Control charts
1: stabiele performantie: goede accuraatheid +
precisie → resultaten liggen binnen aanvaardbare
grenzen
2: verschuiving in gemiddelde: accuraatheid ↓, maar
precisie blijft goed → alle metingen systematisch
fout
3: toename in spreiding (SD): accuraatheid ok, maar
precisie ↓ → meer meetwaarden buiten de grenzen
1 2 3
Page 6 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
Kwaliteitscontrole: extern – voorbeeld
Trace Element Quality Assessment Programme (University of Guilford, UK):
• 3 stalen / maand met onbekende concentraties, verspreid over 6 maanden
• Elk staal wordt 2x verstuurd op willekeurige tijdstippen
• Resultaten worden geëvalueerd via:
o Accuraatheid:
§ Recovery van toegevoegde stof (bekijken hoeveel van de toegevoegde stof correct werd
teruggevonden)
§ Afwijking tov gemiddelde van alle deelnemende labo’s
o Precisie:
§ Verschil tussen de duplo-analyses van hetzelfde staal
3. KALIBRATIE VAN BIOCHEMISCHE ANALYSE
Kalibratie van de analysemethode
Doel van kalibratie: bepalen van de relatie tussen signaal (y) en de concentratie (x) → kalibratiefunctie: 𝑦 = 𝑓(𝑥)
De omgekeerde functie (= meetfunctie) laat toe om uit een meetsignaal de concentratie te berekenen: 𝑥 = 𝑓 # (𝑦)
Wordt opgesteld mbv kalibratoren (stalen met gekende concentraties).
EXTERNE EN INTERNE KALIBRATIEMETHODEN
Externe kalibratie:
• Stalen waarvan concentratie is gekend – apart gemeten
• Toepasbaar als geen matrixeffecten aanwezig zijn
• Gebruik bij eenvoudige, waterige stalen
= directe kalibratie
Eénpuntskalibratie 𝑆𝑥 (onbekend signaal) vergeleken met één 𝑆𝑠 (bekende standaard)
!. !: !:
9.
= 9: ⟺ 𝐶𝑥 = 𝐶𝑠 ∗ !.
Nadeel: minder nauwkeurig, want slechts één ijkpunt → lineariteit moet worden aangetoond.
Meerpuntskalibratie • Verdunningsreeks van standaarden (≥ concentraties)
(ijklijn) • Ijklijn opstellen en onbekende extrapoleren
• Resultaat vermenigvuldigen met verdunningsfactor
Page 7 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
• Niet extrapoleren buiten het bereik van ijklijn !
↳ Grotere verdunning
↳ Kleinere monstername
Voor sommige analyses (bv methode Lowry voor eiwitbepaling) bestaat er geen lineaire relatie
→ gebruik maken van niet-lineaire regressie of log-transformatie
Interne kalibratie:
• Kalibrator wordt in hetzelfde staal gemeten als onbekende
• Nodig bij matrixinterferentie of onstabiele meetomstandigheden
Standaardadditie Wanneer de hoogte vh gegenereerd signaal verschilt tgv verschil in samenstelling vd matrix
(enkelpunt of tussen een (waterige) standaardoplossing en de matirx vh te analyseren staal, maar ook tussen
meerpunt) stalen onderling.
Enkelvoudige (enkelpunts) standaard-additiemethode:
Meet twee oplossingen van hetzelfde staal:
1. Zonder standaard (𝑆𝑥)
2. Met toegevoegde standaard (𝑆𝑥 + 𝑠)
Berekening:
;. !:
𝐶𝑥 = 𝐶𝑠 ∗ ;: ∗ !. waarbij 𝑆𝑠 = 𝑆(𝑥 + 𝑠) − 𝑆𝑥
Belangrijk:
• Bij voorkeur dezelfde verdunning voor onbekende en geaddeerd staal
• Beide metingen moeten onder exact dezelfde omstandigheden worden uitgevoerd
• Lineariteit vd analysemethode moet op voorhand gecontroleerd zijn
Accuraatheid is afhankelijk van slechts één punt → minder robuust
Meervoudige (meerpunts) standaard-additiemethode:
• Aan elk staal worden meerdere hoeveelheden standaard toegevoegd
• Voor elk staal wordt een eigen ijklijn opgesteld
• Extrapolatie van lijn geeft de oorspronkelijke concentratie (snijpunt x-as)
Voordelen Nadelen
• Betere controle over lineariteit • Tijdrovend, want vereist meedere metingen per
• Nauwkeuriger, vooral bij staal
complexe matrices • Vereist relatief grote staalvolumes
• Moderne toestellend kunnen
standaardtoevoegingen soms automatisch
uitvoeren
Page 8 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
I.t.t. externe kalibratie gaat de lijn niet door de oorsprong, omdat het staal zelf al een analyt bevat
voor toevoeging.
Het snijpunt met de x-as geeft de initiële analytconcentratie
Additie-kalibratie 🧪 Als de matrix (de achtergrond waarin de stof zich bevindt) van de verschillende biologische
stalen vergelijkbaar is, en dus het signaal onderling niet beïnvloedt, maar die matrix wél een
effect heeft wanneer je vergelijkt met een eenvoudige waterige standaard, dan is er sprake van
een matrixeffect ten opzichte van de standaard.
• Matrix van alle stalen is gelijk → slechts één staal wordt verrijkt
• Ijklijn kan ook voor andere stalen gebruikt worden
Kalibratieplot:
Interne standaardisatie ⟺ externe standaardisatie
Extern (waterige standaard): rechte door oorsprong – laagste concentratie = blanco staal
Bij matrix A: dezelfde rico als waterige standaard = externe kalibratie
Bij matrix B: rico verandert bij toevoeging onbekende = interne kalibratie
Page 9 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
1. Analytische performantie 3
Aard van de analyse 3
Selectiviteit en specificiteit 3
Gevoeligheid (sensititiveit) 3
Blancobepaling 3
Detectielimiet en kwantificatielimiet 4
Accuraatheid 4
Precisie 5
Accuraatheid en precisie 5
Concentratie van een bestanddeel, SD (standaardeviatie) en VC (variatiecoëfficiënt 5
LOD, LOQ, LOL en dynamisch bereik 6
2. KWaliteitscontrole van de biochemische analyse 6
Control charts 6
Kwaliteitscontrole: extern – voorbeeld 7
3. Kalibratie van biochemische analyse 7
Kalibratie van de analysemethode 7
4. Verschillende fasen van biochemische analyse 11
Definiëren van het analyseprobleem 11
Monstername 11
Voorbereiden van het monster 11
Procedures voor eliminatie van interferenties of aanrijking van de concentratie 11
5. Fouten in kwantitatieve analyse 12
Twee types fouten 12
Resultaten verwerpen (outliers) 12
1. Inleiding 13
Radioactiviteit: atoomstructuur 13
Radioactiviteit: atomaire stabiliteit en straling 13
Radioactiviteit 14
2. Detectie en meting van radioactiviteit 15
Radioactiviteit: interactie van radioactiviteit met materie 15
Detectie en meting radioactiviteit: gasionisatie 17
Detectie en meting van radioactiviteit: excitatie 17
3. Biologische effecten 21
4. Toepassingen in de biologie / biochemie 21
Onderzoek van metabolisme 21
Analytische toepassing 21
Page 1 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
1. Inleiding 23
De elektrochemie is essentieel gebasseerd op drie betrekkingen 23
Elektrolytoplossingen, elektrolyse en elektrochemische cellen 24
2. POtentiaalverschil tussen metaal en oplossing (zonder een opgelegd extern potentiaalverschil) 26
De elektrodepotentiaal 26
Standaard elektrodepotentiaal 27
Betrekking van Nernst voor… 28
3. Elektrochemische cellen 29
De galvanische cel 29
De elektrolysecel 30
4. Analytische methoden gebaseerd op elektrochemische bepalingen 30
5. Biosensoren 40
Biosensoren: concept 40
Biosensoren: enzyme-gebaseerde biosensoren met amperometrische detectie 40
Biosensoren: enzym-gebaseerde potentiometrische biosensoren 41
Page 2 of 41
, Hoofdstuk 1: analytische performantie, kwaliteitscontrole enAnalytische
kalibratie biochemie 2 | YS
1. ANALYTISCHE PERFORMANTIE
Aard van de analyse
Kwalitatieve analyse = toont aanwezigheid / afwezigheid van 1 of meerdere componenten.
Kwantitatieve analyse = meet de hoeveelheid van 1 of meerdere componenten.
• Individuele analyse: 1 specifieke stof (bv glucose)
• Groepsanalyse: meerdere verwante stoffen (bv totaal eiwitgehalte)
Alle analyses meten een fysische of fysio-chemische grootheid die (on)rechtstreeks evenredig is met de hoeveelheid te
doseren bestanddeel: massa, volume, stroomsterkte, …
Selectiviteit en specificiteit
Selectiviteit = test geeft voorkeur voor een bepaalde stof, maar kan ook reageren op andere stoffen.
Specificiteit = test reageert enkel op de gewenste stof → verbeterbaar via pH, temperatuur, complexvorming, eliminatie
storende factoren, …
Finaal dient de ideale test 100% specifiek te zijn = het geregistreerde signaal is enkel en alleen afkomstig van het analyt.
Gevoeligheid (sensititiveit)
Gevoeligheid = helling van ijkcurve = gemeten signaal / concentratie = signaal
per concentratie-eenheid.
ð Niet altijd hoge gevoeligheid nodig (afhankelijk van analyt)
Karakteristieke concentratie = hoeveelheid (𝜇𝑔 = 10!" 𝑔) van de te bepalen
stof die een absorbantie van 0,0044 (= 1% absorptie) teweegbrengt.
ð Uitgedrukt als 𝜇𝑔/𝑚𝐿/𝐼% 𝑎𝑏𝑠 of 𝜇𝑔/𝑔/𝐼% 𝑎𝑏𝑠
ð Gepubliceerde gevoeligheidswaarden = uitstekende referentie voor afstellen + kalibreren apparatuur en/of
controleren of de analyse betrouwbaar is
Blancobepaling
= achtergrondsignaal (background) = bepaling van de fractie vh totaalsignaal die niet te wijten is aan het te doseren
bestanddeel in het te analyseren staal.
Bijvoorbeeld: in spectrofotometrie: absorptie (= signaal) bijdrage solvent + reagentia – solvent kan ook licht absorberen
dus correctie nodig door absorptie te meten van solvent alleen (= background) en af te trekken vd signalen vd stalen.
Page 3 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
Detectielimiet en kwantificatielimiet
LOD (limit of detection) = minimaal meetbare concentratie → 2x achtergrondsignaal of 3x SD (= standaarddeviatie) van
blank signaal.
= concentratie die signaal / ruis verhouding van 2 veroorzaakt (S/N = signal-to-noise ratio)
↳ Kwalitatieve bepalingen
LOQ (limit of quantification) = laagste concentratie die kwantitatief kan worden bepaald → 10x SD van blank signaal
↳ Kwantitatieve bepalingen
LOD ≠ gevoeligheid !
ILLUSTRATIEF VOORBEELD
Gevoeligheid (sensitiviteit) is hetzelfde want beide methoden hebben een gemiddelde rond dezelfde hoogte.
Detectielimiet is hoger bij methode A omdat er meer variatie zit in het signaal → bij lagere concentratie al detectielimiet
vaststellen.
Accuraatheid
= maat voor afwijking van experimenteel gevonden analyseresultaat tov onbekende werkelijke waarde
= hoe dicht meetresultaat bij werkelijke waarde ligt.
ð Men stelt bepaalde eisen voor accuraatheid waarmee analyseresultaat dient gekendt te zijn: bv max. afwijking van
5%
ð Om accuraatheid van methode te bepalen → baseren op analyseren van “met certificaat voorziende”
standaardmonsters van erkende instituten
↳ Bv: National Bureau of Standars and Technology (USA) – British Standard Institute – National Institute of Health
(USA) – Community Bureau of Reference
Page 4 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
Precisie
= maat voor preproduceerbaarheid van de analyseresultaten.
Intra-run = reproduceerbaarheid binnen één analyse; gemiddelde afwijking tov gemiddelde tijdens 1 run i.e. onder
dezelfde condities (= within-run precision of repeatability)
↳ Bv: 10x achter elkaar meten
Inter-run = reproduceerbaarheid over verschillende runs; gemiddelde afwijking tov gemiddelde bij verschillende runs
onder veranderde conditites (= between-run precision of reproducibility)
↳ Bv: elke maandag
!"#$%##&%%'()#")' (!,)(#$ ('&./0)11'$%' 2'")$3'$ (#$ 0'"4'15%' ."##1 !,
Variatiecoëfficiënt (VC) = =
6'2)%%'1%' 7##&%' (8) (#$ ('&./0)11'$%' 2'")$3'$ (#$ 0'"4 15%' ."##1 8
ð Lage VC = hoge precisie
ð Accuraatheid ≠ precisie (je kan precies zijn, maar foutief)
Accuraatheid en precisie
Gemiddelde vd metingen ligt in rode Metingen liggen dichtbij elkaar (= Metingen zijn precies (liggen dichtbij
bol (= accuraat), maar waarde liggen precies), maar gemiddelde ligt niet in elkaar) en accuraat (gemiddelde ligt
ver van elkaar (= niet precies) rode bol (= niet accuraat) in rode bol)
Concentratie van een bestanddeel, SD (standaardeviatie) en VC (variatiecoëfficiënt
• SD blijft gelijk over • SD stijgt met concentratie, in • SD daalt mee met concentreatie,
concentratiebereik verhouding tot gemiddelde maar stopt op bepaalde punt
• Bij lage concentraties is VC hoog, • VC blijft gelijk → precisie is stabiel • Bij zeer lage concentraties stijgt
omdat spreiding groot is tov over hele meetgebied VC opnieuw, omdat SD relatief
gemiddelde groot blijft
Page 5 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
SD (standaarddeviatie) = absolute maat voor de spreiding van de meetresultaten
VC (variatiecoëfficiënt) = relatieve maat = SD gedeeld door gemiddelde, in % uitgedrukt
↳ Geeft de precisie aan: hoe lager VC, hoe beter precisie
Precisie (VC) is vaak concentratie-afhankelijk → daarom moet je precies bepalen bij meerdere concentraties, niet slechts
bij één.
LOD, LOQ, LOL en dynamisch bereik
LOD = limit of detection → 2x achtergrond of 3x SD van
achtergrondsignaal
LOQ = limit of quantification → 10x SD van achtergrondsignaal
LOL = limit of linearity = hoogste concenteatie waarbij lineair
verband nog geldt → lineair verloopt grafiek stopt
Helling = gevoeligheid (sensitiviteit)
Achtergrond ruis wordt afgetrokken van gemeten signaal
Dynamisch bereik ligt tussen LOQ en LOL = bereik waarin we kwantificatie kunnen uitvoeren → hierin metingen uitvoeren
2. KWALITEITSCONTROLE VAN DE BIOCHEMISCHE ANALYSE
Control charts
1: stabiele performantie: goede accuraatheid +
precisie → resultaten liggen binnen aanvaardbare
grenzen
2: verschuiving in gemiddelde: accuraatheid ↓, maar
precisie blijft goed → alle metingen systematisch
fout
3: toename in spreiding (SD): accuraatheid ok, maar
precisie ↓ → meer meetwaarden buiten de grenzen
1 2 3
Page 6 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
Kwaliteitscontrole: extern – voorbeeld
Trace Element Quality Assessment Programme (University of Guilford, UK):
• 3 stalen / maand met onbekende concentraties, verspreid over 6 maanden
• Elk staal wordt 2x verstuurd op willekeurige tijdstippen
• Resultaten worden geëvalueerd via:
o Accuraatheid:
§ Recovery van toegevoegde stof (bekijken hoeveel van de toegevoegde stof correct werd
teruggevonden)
§ Afwijking tov gemiddelde van alle deelnemende labo’s
o Precisie:
§ Verschil tussen de duplo-analyses van hetzelfde staal
3. KALIBRATIE VAN BIOCHEMISCHE ANALYSE
Kalibratie van de analysemethode
Doel van kalibratie: bepalen van de relatie tussen signaal (y) en de concentratie (x) → kalibratiefunctie: 𝑦 = 𝑓(𝑥)
De omgekeerde functie (= meetfunctie) laat toe om uit een meetsignaal de concentratie te berekenen: 𝑥 = 𝑓 # (𝑦)
Wordt opgesteld mbv kalibratoren (stalen met gekende concentraties).
EXTERNE EN INTERNE KALIBRATIEMETHODEN
Externe kalibratie:
• Stalen waarvan concentratie is gekend – apart gemeten
• Toepasbaar als geen matrixeffecten aanwezig zijn
• Gebruik bij eenvoudige, waterige stalen
= directe kalibratie
Eénpuntskalibratie 𝑆𝑥 (onbekend signaal) vergeleken met één 𝑆𝑠 (bekende standaard)
!. !: !:
9.
= 9: ⟺ 𝐶𝑥 = 𝐶𝑠 ∗ !.
Nadeel: minder nauwkeurig, want slechts één ijkpunt → lineariteit moet worden aangetoond.
Meerpuntskalibratie • Verdunningsreeks van standaarden (≥ concentraties)
(ijklijn) • Ijklijn opstellen en onbekende extrapoleren
• Resultaat vermenigvuldigen met verdunningsfactor
Page 7 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
• Niet extrapoleren buiten het bereik van ijklijn !
↳ Grotere verdunning
↳ Kleinere monstername
Voor sommige analyses (bv methode Lowry voor eiwitbepaling) bestaat er geen lineaire relatie
→ gebruik maken van niet-lineaire regressie of log-transformatie
Interne kalibratie:
• Kalibrator wordt in hetzelfde staal gemeten als onbekende
• Nodig bij matrixinterferentie of onstabiele meetomstandigheden
Standaardadditie Wanneer de hoogte vh gegenereerd signaal verschilt tgv verschil in samenstelling vd matrix
(enkelpunt of tussen een (waterige) standaardoplossing en de matirx vh te analyseren staal, maar ook tussen
meerpunt) stalen onderling.
Enkelvoudige (enkelpunts) standaard-additiemethode:
Meet twee oplossingen van hetzelfde staal:
1. Zonder standaard (𝑆𝑥)
2. Met toegevoegde standaard (𝑆𝑥 + 𝑠)
Berekening:
;. !:
𝐶𝑥 = 𝐶𝑠 ∗ ;: ∗ !. waarbij 𝑆𝑠 = 𝑆(𝑥 + 𝑠) − 𝑆𝑥
Belangrijk:
• Bij voorkeur dezelfde verdunning voor onbekende en geaddeerd staal
• Beide metingen moeten onder exact dezelfde omstandigheden worden uitgevoerd
• Lineariteit vd analysemethode moet op voorhand gecontroleerd zijn
Accuraatheid is afhankelijk van slechts één punt → minder robuust
Meervoudige (meerpunts) standaard-additiemethode:
• Aan elk staal worden meerdere hoeveelheden standaard toegevoegd
• Voor elk staal wordt een eigen ijklijn opgesteld
• Extrapolatie van lijn geeft de oorspronkelijke concentratie (snijpunt x-as)
Voordelen Nadelen
• Betere controle over lineariteit • Tijdrovend, want vereist meedere metingen per
• Nauwkeuriger, vooral bij staal
complexe matrices • Vereist relatief grote staalvolumes
• Moderne toestellend kunnen
standaardtoevoegingen soms automatisch
uitvoeren
Page 8 of 41
, Analytische biochemie 2 | YS
I.t.t. externe kalibratie gaat de lijn niet door de oorsprong, omdat het staal zelf al een analyt bevat
voor toevoeging.
Het snijpunt met de x-as geeft de initiële analytconcentratie
Additie-kalibratie 🧪 Als de matrix (de achtergrond waarin de stof zich bevindt) van de verschillende biologische
stalen vergelijkbaar is, en dus het signaal onderling niet beïnvloedt, maar die matrix wél een
effect heeft wanneer je vergelijkt met een eenvoudige waterige standaard, dan is er sprake van
een matrixeffect ten opzichte van de standaard.
• Matrix van alle stalen is gelijk → slechts één staal wordt verrijkt
• Ijklijn kan ook voor andere stalen gebruikt worden
Kalibratieplot:
Interne standaardisatie ⟺ externe standaardisatie
Extern (waterige standaard): rechte door oorsprong – laagste concentratie = blanco staal
Bij matrix A: dezelfde rico als waterige standaard = externe kalibratie
Bij matrix B: rico verandert bij toevoeging onbekende = interne kalibratie
Page 9 of 41
