Genoom HC - Deel II – uitwerkingen
Hoorcollege 1
Elke analyse meet iets op een bepaald niveau.
Bestuderen in de cel = in vivo (in leven)
Bestuderen in een reageerbuis = in vitro
Hoorcollege 2 – 14-01-2019
P53null cellen zijn cellen van een humane cellijn die geen p53 bevatten maar waar wél extra DNA in
kan worden toegevoegd om overexpressie van p53 te creëren.
Expression vector;
- ORI
- Promotor
- MCS
- Poly-A-signaal
- Ampicilline resistentie
Heatshock zorgt voor een instabiele celwand zodat DNA de celwand van de hostcel kan passeren
Drukverschil wordt gecreëerd waardoor het DNA de cel kan binnendringen omdat de fosfolipiden van
de bi-laag van de celwand gedestabiliseerd worden.
E.coli moet vermeerderen groeien
DNA isolatie gel-elektroforese, isolatie & sequencing
Site directed mutagenesis expres een mutatie aanbrengen in een primer
Forward primer bindt aan template streng
5’ primer 3’
3’ template streng 5’
Reverse primer (moet nog complementair worden gemaakt en als het ware omgekeerd (van
3’naar5’)
5’ streng 3’
3’ primer 5’
Taq polymerase ipv DNA polymerase
Pas na 2 cycli heb je vermeerde target DNA (!)
, Transformeren met bacteriën
Transfectie eukaryotische cellen
Genomische DNA bank:
- Elk stukje uit het genoom, exons, introns, repetitief DNA, promotorgebieden, etc.
cDNA bank:
- mRNA van het ‘genoom’, niet elk stukje DNA, alleen eiwit-coderend DNA
- weefsel- en celtype-specifiek hierdoor dan ook meer cDNA’s
Gekloneerd DNA met onbekende sequentie kun je alsnog heel gemakkelijk sequensen omdat je dit in
de MCS hebt gezet, je hoeft dus puur primers te ontwikkelen voor de MSC en die dus complementair
zijn aan de stukjes MCS.
Cmv-promotor = sterke promotor van virussen nodig voor overexpressie van eiwitten
Fusie-eiwit
- eiwit met een stukje daaraan vast, in-frame
- stopcodon haal je weg, nieuwe aminozuurcode wordt ingebouwd
- HIS-tag (bindt heel sterk aan glutation, bevat veel histidines) of GST-tag
Reporter-gen
- Plasmide bevat één MCS maar twee promotors (U6 en Cmv)
- ‘Deze cel bevat het juiste plasmide’ boodschap dat de transformatie/transfectie gelukt is,
cel wordt groen opgelicht
Sh-RNA (short hairpin RNA)
- Stukje RNA dat met zichzelf kan loopen + terminatie sequentie van heel veel TTTTTT
- DNA inbrengen waar RNA uit komt, loopt met zichzelf en is complementair aan elkaar, shRNA
- Wordt direct herkend door eiwitten voor mRNA degradatie/RNA-interferentie etc.
- Zo wordt mRNA afgebroken en kan worden onderzocht hoe de cel reageert als een bepaald
eiwit niet tot nauwelijks tot expressie kan worden gebracht omdat het mRNA wordt
afgebroken door shRNA
1. Synthetische siRNA’s direct inspuiten (transfecteren)
2. Cellen transfecteren met een plasmide dat codeert voor het shRNA
3. Een gemodificeerd virus dat na infectie integreert in het genoom en codeert voor het shRNA
Hoorcollege 1
Elke analyse meet iets op een bepaald niveau.
Bestuderen in de cel = in vivo (in leven)
Bestuderen in een reageerbuis = in vitro
Hoorcollege 2 – 14-01-2019
P53null cellen zijn cellen van een humane cellijn die geen p53 bevatten maar waar wél extra DNA in
kan worden toegevoegd om overexpressie van p53 te creëren.
Expression vector;
- ORI
- Promotor
- MCS
- Poly-A-signaal
- Ampicilline resistentie
Heatshock zorgt voor een instabiele celwand zodat DNA de celwand van de hostcel kan passeren
Drukverschil wordt gecreëerd waardoor het DNA de cel kan binnendringen omdat de fosfolipiden van
de bi-laag van de celwand gedestabiliseerd worden.
E.coli moet vermeerderen groeien
DNA isolatie gel-elektroforese, isolatie & sequencing
Site directed mutagenesis expres een mutatie aanbrengen in een primer
Forward primer bindt aan template streng
5’ primer 3’
3’ template streng 5’
Reverse primer (moet nog complementair worden gemaakt en als het ware omgekeerd (van
3’naar5’)
5’ streng 3’
3’ primer 5’
Taq polymerase ipv DNA polymerase
Pas na 2 cycli heb je vermeerde target DNA (!)
, Transformeren met bacteriën
Transfectie eukaryotische cellen
Genomische DNA bank:
- Elk stukje uit het genoom, exons, introns, repetitief DNA, promotorgebieden, etc.
cDNA bank:
- mRNA van het ‘genoom’, niet elk stukje DNA, alleen eiwit-coderend DNA
- weefsel- en celtype-specifiek hierdoor dan ook meer cDNA’s
Gekloneerd DNA met onbekende sequentie kun je alsnog heel gemakkelijk sequensen omdat je dit in
de MCS hebt gezet, je hoeft dus puur primers te ontwikkelen voor de MSC en die dus complementair
zijn aan de stukjes MCS.
Cmv-promotor = sterke promotor van virussen nodig voor overexpressie van eiwitten
Fusie-eiwit
- eiwit met een stukje daaraan vast, in-frame
- stopcodon haal je weg, nieuwe aminozuurcode wordt ingebouwd
- HIS-tag (bindt heel sterk aan glutation, bevat veel histidines) of GST-tag
Reporter-gen
- Plasmide bevat één MCS maar twee promotors (U6 en Cmv)
- ‘Deze cel bevat het juiste plasmide’ boodschap dat de transformatie/transfectie gelukt is,
cel wordt groen opgelicht
Sh-RNA (short hairpin RNA)
- Stukje RNA dat met zichzelf kan loopen + terminatie sequentie van heel veel TTTTTT
- DNA inbrengen waar RNA uit komt, loopt met zichzelf en is complementair aan elkaar, shRNA
- Wordt direct herkend door eiwitten voor mRNA degradatie/RNA-interferentie etc.
- Zo wordt mRNA afgebroken en kan worden onderzocht hoe de cel reageert als een bepaald
eiwit niet tot nauwelijks tot expressie kan worden gebracht omdat het mRNA wordt
afgebroken door shRNA
1. Synthetische siRNA’s direct inspuiten (transfecteren)
2. Cellen transfecteren met een plasmide dat codeert voor het shRNA
3. Een gemodificeerd virus dat na infectie integreert in het genoom en codeert voor het shRNA
