H1: basisaspecten
1. inleiding
• microbiologie:
o = studie van micro-organismen MO (= enkel zichtbaar met licht- (tot 0,5µ) of elektronenmicroscoop)
bacterie - eencellige prokaryoot (1µ) zichtbaar met microscoop
• bevat: chromosomen, ribosomen, vacuole, cytoplasma, plasmide, flagel, celmmb, celwand,…
virussen - eencellige virale structuur (0,1µ) niet zichtbaar
• bevat: envelop, capsiden, genetisch materiaal (DNA or RNA)
fungi - een-/meercellige eukaryoot (100µ) uitgroeien tot schimmeldek: zichtbaar met blote oog
• zoals menselijke, dierlijke cel
• bevat: celkern, chromosomen, ER, Mt, ribosomen, golgi, cytoplasma, celmmb,…
o leven in symbiose:
▪ parasitisme => schadelijk voor één van de twee (bv. virus & gastheercel)
▪ mutualisme => gunstig voor beiden (bv. vaginale epitheelcellen & Lactobacielen)
▪ commensalisme => gunstig voor ene, neutraal voor anderen (bv. mondbacterie)
o vaststellingen:
▪ er zijn veel meer MO (1014) dan alle cellen in het lichaam (1013)
▪ enkel in mondholte: 1010 MO (700 ≠ soorten)
▪ per mm dieper in pocket gaan; 101 extra bacterie (bv. pocket van 8mm == 108 bacterie)
• immunologie:
o = studie v/h immuunsysteem; hoe een lichaam reageert op een pathologie
▪ werkt protectief
▪ kan tot ziekte leiden:
• aangeboren immuunsysteem leidt tot ontsteking en weefselschade
• immunodeficiëntie => minder goed infecties bestrijden
• overgevoelig/ overmatig werken:
o voor eigen lichaam (= auto-immuniteit)
o voor onschadelijke stoffen (= allergieën)
2. GRAM-kleuring
• algemeen:
o kleuring gebaseerd op verschillen in buitenopp. van bacterie
o soorten bacterie:
gram + gram -
- celmembraan - celmembraan
- dikker celwand - dunne celwand
- extra: buiten membraan uit lipopolysachariden
=> virulent bij parodontale infecties!
• hoe?
1) bacterie in 0,9% NaCl
2) fixeren door verhitting
3) gebruikte kleurstoffen => kristalviolet en lugol kleuren bacterie paars
4) kleurstoffen wegnemen door alcohol
o gram+ => dikker wand; moeilijker om kleurstof weg te nemen paars
o gram- => dunner wand; kleurstof weg kleurloos
5) fuchsine kleurstof toevoegen=> gram- roze kleuren
1
,3. subgingivale plaque opname
• hoe?
1) contaminaties, supragingivale plaque, tandsteen,… verwijderen
2) sample nemen uit pocket:
o steriele papierpunten insteken: 30µ => diepste regio van pocket (150µ) bereiken!
o steriele curette: 800µ => moelijker diepste punt te bereiken!
3) sample in steriele tube plaatsen
4. bacteriële identificatie
4.1. visualisatie en classificatie
• licht microscoop:
o structuren max 0,5µ zichtbaar
o grootte EN morfologie
o statisch techniek => bacterie moet dood zijn
o obv verschillen in lichtabsorptie en -breking (bacterie heeft geen van beide dus GRAM-kleuren!)
• donkerveld microscoop:
o object belichten onder stompe hoek => opgelicht object op donker achtergrond
o grootte EN morfologie
o dynamisch techniek => bewegende bacterie
▪ goedkoper (geen kleuring)
▪ patiënt kan beweeglijkheid zien => motivatie verbetering mondhygiëne!
4.2. identificatie
• cultuur kweken:
o detectielimiet 104 == in een staal moeten er 104 bacterie aanwezig zijn om die te kunnen identificere
o hoe?
1) perfecte omstandigheden creëren (luchtsamenstelling, voedingsbodem,…) om te groeien
2) kleuren
3) biochemische testen toepassen
• immunologische technieken:
o detectielimiet 104-105
o hoe?
1) gemodificeerde antilichamen toevoegen aan te detecteren kiem
2) visualisatie via:
o immunofluorescentie => fluorescerende-antilichaam visualiseren dr fluorescentieMP
o radio-isotopen => radio-immunosorbent-assay (RIA): via radioactief gelabelde AL
o enzymatische reactie => enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA)
▪ specifieke EW (antilichamen) detecteren door binding aan een enzym
▪ zo kleurverandering meten
• moleculaire technieken:
o PCR (Polymerase Chain Reaction):
▪ DNA exponentieel toenemen
▪ visualisatie door elektroforese (signaal = maat vr de hoeveelheid ingebrachte DNA
▪ drie vormen:
• Conventioneel PCR => indien één gen detecteren
• Multiplex PCR => meerdere genen tegelijk
• Real time PCR => visualisatie door fluorescente agentia op elk moment v/d reactie
o detectielimiet 102
2
, o andere:
▪ oligonucleotide probes:
• detectielimiet 104
• denaturatie microbieel DNA complementaire prope toevoegen hybridisatie
▪ whole genomics prope:
• in één reactie 40 kiemen tegelijk identificeren en kwantificeren
• naadeel => frequente kruisreacties tss meerdere kiemen
o dus detectielimiet 105
4.3. besluit detectielimieten
kweken 104
immunologische technieken 104-105
real-time PCR 102
oligonucleotide probes 104
WGP 105
• beste => real-time PCR: heel weinig bacterie nodig om ze te kunnen identificeren
• slechtste => WGP: heel veel bacterie nodig om ze te kunnen identificeren
3
1. inleiding
• microbiologie:
o = studie van micro-organismen MO (= enkel zichtbaar met licht- (tot 0,5µ) of elektronenmicroscoop)
bacterie - eencellige prokaryoot (1µ) zichtbaar met microscoop
• bevat: chromosomen, ribosomen, vacuole, cytoplasma, plasmide, flagel, celmmb, celwand,…
virussen - eencellige virale structuur (0,1µ) niet zichtbaar
• bevat: envelop, capsiden, genetisch materiaal (DNA or RNA)
fungi - een-/meercellige eukaryoot (100µ) uitgroeien tot schimmeldek: zichtbaar met blote oog
• zoals menselijke, dierlijke cel
• bevat: celkern, chromosomen, ER, Mt, ribosomen, golgi, cytoplasma, celmmb,…
o leven in symbiose:
▪ parasitisme => schadelijk voor één van de twee (bv. virus & gastheercel)
▪ mutualisme => gunstig voor beiden (bv. vaginale epitheelcellen & Lactobacielen)
▪ commensalisme => gunstig voor ene, neutraal voor anderen (bv. mondbacterie)
o vaststellingen:
▪ er zijn veel meer MO (1014) dan alle cellen in het lichaam (1013)
▪ enkel in mondholte: 1010 MO (700 ≠ soorten)
▪ per mm dieper in pocket gaan; 101 extra bacterie (bv. pocket van 8mm == 108 bacterie)
• immunologie:
o = studie v/h immuunsysteem; hoe een lichaam reageert op een pathologie
▪ werkt protectief
▪ kan tot ziekte leiden:
• aangeboren immuunsysteem leidt tot ontsteking en weefselschade
• immunodeficiëntie => minder goed infecties bestrijden
• overgevoelig/ overmatig werken:
o voor eigen lichaam (= auto-immuniteit)
o voor onschadelijke stoffen (= allergieën)
2. GRAM-kleuring
• algemeen:
o kleuring gebaseerd op verschillen in buitenopp. van bacterie
o soorten bacterie:
gram + gram -
- celmembraan - celmembraan
- dikker celwand - dunne celwand
- extra: buiten membraan uit lipopolysachariden
=> virulent bij parodontale infecties!
• hoe?
1) bacterie in 0,9% NaCl
2) fixeren door verhitting
3) gebruikte kleurstoffen => kristalviolet en lugol kleuren bacterie paars
4) kleurstoffen wegnemen door alcohol
o gram+ => dikker wand; moeilijker om kleurstof weg te nemen paars
o gram- => dunner wand; kleurstof weg kleurloos
5) fuchsine kleurstof toevoegen=> gram- roze kleuren
1
,3. subgingivale plaque opname
• hoe?
1) contaminaties, supragingivale plaque, tandsteen,… verwijderen
2) sample nemen uit pocket:
o steriele papierpunten insteken: 30µ => diepste regio van pocket (150µ) bereiken!
o steriele curette: 800µ => moelijker diepste punt te bereiken!
3) sample in steriele tube plaatsen
4. bacteriële identificatie
4.1. visualisatie en classificatie
• licht microscoop:
o structuren max 0,5µ zichtbaar
o grootte EN morfologie
o statisch techniek => bacterie moet dood zijn
o obv verschillen in lichtabsorptie en -breking (bacterie heeft geen van beide dus GRAM-kleuren!)
• donkerveld microscoop:
o object belichten onder stompe hoek => opgelicht object op donker achtergrond
o grootte EN morfologie
o dynamisch techniek => bewegende bacterie
▪ goedkoper (geen kleuring)
▪ patiënt kan beweeglijkheid zien => motivatie verbetering mondhygiëne!
4.2. identificatie
• cultuur kweken:
o detectielimiet 104 == in een staal moeten er 104 bacterie aanwezig zijn om die te kunnen identificere
o hoe?
1) perfecte omstandigheden creëren (luchtsamenstelling, voedingsbodem,…) om te groeien
2) kleuren
3) biochemische testen toepassen
• immunologische technieken:
o detectielimiet 104-105
o hoe?
1) gemodificeerde antilichamen toevoegen aan te detecteren kiem
2) visualisatie via:
o immunofluorescentie => fluorescerende-antilichaam visualiseren dr fluorescentieMP
o radio-isotopen => radio-immunosorbent-assay (RIA): via radioactief gelabelde AL
o enzymatische reactie => enzyme-linked-immunosorbent-assay (ELISA)
▪ specifieke EW (antilichamen) detecteren door binding aan een enzym
▪ zo kleurverandering meten
• moleculaire technieken:
o PCR (Polymerase Chain Reaction):
▪ DNA exponentieel toenemen
▪ visualisatie door elektroforese (signaal = maat vr de hoeveelheid ingebrachte DNA
▪ drie vormen:
• Conventioneel PCR => indien één gen detecteren
• Multiplex PCR => meerdere genen tegelijk
• Real time PCR => visualisatie door fluorescente agentia op elk moment v/d reactie
o detectielimiet 102
2
, o andere:
▪ oligonucleotide probes:
• detectielimiet 104
• denaturatie microbieel DNA complementaire prope toevoegen hybridisatie
▪ whole genomics prope:
• in één reactie 40 kiemen tegelijk identificeren en kwantificeren
• naadeel => frequente kruisreacties tss meerdere kiemen
o dus detectielimiet 105
4.3. besluit detectielimieten
kweken 104
immunologische technieken 104-105
real-time PCR 102
oligonucleotide probes 104
WGP 105
• beste => real-time PCR: heel weinig bacterie nodig om ze te kunnen identificeren
• slechtste => WGP: heel veel bacterie nodig om ze te kunnen identificeren
3
