Moleculaire biologie
Inhoud
1. Grondleggers van de moleculaire biologie ........................................................... 4
1.1 Inzichten in de natuur van het erfelijk materiaal............................................ 4
1.2 Een model voor de structuur van DNA .......................................................... 5
1.3 Het centrale dogma .................................................................................... 5
2. De structuur van DNA ........................................................................................ 6
2.1 De primaire structuur van DNA .................................................................... 6
2.2 De secundaire structuur ............................................................................. 7
2.3 Denaturatie en renaturatie van DNA ............................................................. 8
2.4 De tertiaire structuur .................................................................................. 9
3. Genoomorganisatie en evolutie ........................................................................ 10
3.1 Vele genoomsequenties zijn ontrafeld ........................................................ 10
3.2 Variaties in genoomorganisatie .................................................................. 11
3.3 Eukaryote genomen bevatten veel repetitief DNA ........................................ 12
3.4 Extrachromosomaal DNA en horizontale gentransfer .................................. 14
3.5 Genenclusters.......................................................................................... 16
3.6 Het menselijk genoomproject .................................................................... 17
3.7 Polymorfisme binnen het menselijk genoom .............................................. 17
3.8 Genoomsequenties van hominiden (grote apen) ......................................... 18
3.9 Condensatie van het genoom .................................................................... 18
4. DNA replicatie ................................................................................................. 21
4.1 DNA replicatie is semi-conservatief ........................................................... 21
4.2 DNA replicatie gebeurt meestal bidirectioneel ............................................ 22
4.3 DNA polymerasen katalyseren DNA synthese van 5' naar 3' ......................... 23
4.4 Multi-eiwit moleculaire machines verzorgen DNA replicatie ......................... 24
4.5 Topo-isomerasen relaxeren “supercoiled” DNA........................................... 27
4.6 Specifieke kenmerken van eukaryote DNA replicatie ................................... 28
4.7 Laboratoriumtechnieken gebaseerd op DNA replicatie ................................ 28
4.7.1 Sanger sequenering ........................................................................... 28
5. DNA schade en herstelmechanismen ............................................................... 30
1
, 5.1 Mutaties en DNA schade ................................................................................ 30
5.2 Mutaties op nucleotide niveau ........................................................................ 31
5.3 Structurele beschadiging van de dubbele helix ................................................ 33
5.4 DNA herstelmechanismen ............................................................................. 33
5.4.1 Mismatch-repair ..................................................................................... 33
5.4.2 Base excision repair ................................................................................ 34
5.4.3 Nucleotide excision repair ....................................................................... 35
5.4.4 Non-homologous End Joining (NHEJ) ........................................................ 35
5.4.5 Homologe recombinatie .......................................................................... 36
5.4.6 Geadapteerd CRISPR CAS9 systeem als toolbox om gericht genomische
varianten te introduceren ................................................................................. 37
6. Het ontstaan van genetische variatie ................................................................ 39
6.1 Puntmutaties ........................................................................................... 39
6.2 Genherschikkingen ................................................................................... 40
6.2.1 Transposons...................................................................................... 40
6.2.2 Retrotransposons en retrovirussen ..................................................... 41
6.2.3 Meiose .............................................................................................. 42
6.2.4 Homologe recombinatie..................................................................... 42
6.2.5 Antilichaamdiversiteit: Somatische recombinatie ................................ 45
6.3 Variaties op chromosoomniveau................................................................ 46
6.4 Variaties op genoomniveau ....................................................................... 47
7. Transcriptie en RNA maturatie ............................................................................. 48
7.1 De structuur van RNA .................................................................................... 48
7.2 De boodschapper tussen DNA en eiwit is RNA ................................................. 49
7.3 Basiskenmerken van transcriptie .................................................................... 51
7.4 Transcriptie bij prokaryoten ............................................................................ 52
7.4.1 De promotor ........................................................................................... 52
7.4.2 Het RNA polymerase ............................................................................... 53
7.4.3 Regulatie van transcriptie ........................................................................ 55
7.4.4 Transcriptie terminatie ............................................................................. 57
7.5 Transcriptie bij eukaryoten ............................................................................. 58
7.5.1 Eukaryoten hebben meerdere RNA polymerasen ....................................... 58
2
, 7.5.2 Eukaryote CIS-elementen ........................................................................ 58
7.5.3 Eukaryote TRANS-factoren ....................................................................... 59
7.5.4 DNA condensatie en transcriptionele regulatie .......................................... 64
7.5.5 Transcriptie door RNA polymerase I en III en mitochondriale transcriptie ..... 69
7.5.6 Transcriptie terminatie ............................................................................. 69
7.6 RNA maturatie ............................................................................................... 70
7.6.1 5’ Capping ......................................................................................... 71
7.6.2 3’ Polyadenylatie ............................................................................... 71
7.6.3 mRNA splicing ................................................................................... 72
7.6.4 mRNA editing .................................................................................... 75
7.6.5 mRNA transport ................................................................................. 76
7.6.6 mRNA stabiliteit ................................................................................ 76
7.6.7 RNA interferentie ............................................................................... 77
7.7 rRNA en tRNA maturatie ............................................................................ 81
7.7.1 rRNA maturatie .................................................................................. 81
7.7.2 tRNA maturatie .................................................................................. 82
8. Eiwitsynthese en eiwitadressering .................................................................... 83
8.1 De genetische code gekraakt .......................................................................... 83
8.2 Het ribosoom ................................................................................................ 84
8.3 De eiwitsynthese ........................................................................................... 84
8.3.1 tRNAs en aminoacyl-tRNA synthetasen .................................................... 85
8.3.2 Het translatieproces ................................................................................ 86
8.4 Gereguleerde eiwitafbraak ............................................................................. 91
8.5 Eiwitadressering ............................................................................................ 93
8.5.1 Sortering van eiwitten aangemaakt op vrij ribosomen ................................. 93
8.5.2 Sortering via het ER en Golgi..................................................................... 95
8.5.3 Endocytose en sortering van opgenomen eiwitten ....................................101
8.5.4 Adressering van eiwitten voor lysosomale afbraak ....................................103
3
,1. Grondleggers van de moleculaire biologie
1.1 Inzichten in de natuur van het erfelijk materiaal
Frederick Griffith (1928): het ‘transforming principle’
Experiment met 2 bacteriestammen
- Rough: niet virulent
- Smooth: virulent
1) Muis is dood
2) Muis leeft, maar is ziek; kan bacterie elimineren
3) Muis is dood, heeft uit het bloed een cultuur gemaakt
van levende smooth bacteriën
➔ Genetisch materiaal van dode, virulente bacteriën (S) werd overgedragen op levende,
niet-virulente (R) bacteriën, waardoor deze ziekmakend werden. → de R-stam heeft
een transforming factor.
Avery, McLeod en McCarthy (1944): DNA is het “transforming principle”
- Ze elimineerden eerst vetten en suikers en koken het
mengsel (waardoor bacteriën stierven)
- Er worden in drie buisjes specifieke enzymen
toegevoegd
- Levende R cellen toevoegen en kijken of ze virulent
worden
- Wanneer S cellen behandeld werden met proteasen
of ribonucleasen => wel transformatie naar levende S-
cellen (dus spelen geen rol)
- Transformase gebeurt niet wanneer DNA kapot
gemaakt is
- DNA = transformerende factor MAAR de wetenschap gelooft dit nog niet doordat
men de verkeerde structuur van DNA in gedachten had
- Wat zou een beperking kunnen zijn van het experiment? Je kon niet 100% zeker
zijn dat de enzymen specifiek waren en dat ze dus maar 1 type biomolecule
konden afbreken
Alfred Hershey & Martha Chase (1950)
Experiment met bacteriofagen = virussen die bacteriën infecteren, bestaan enkel uit
eiwit en DNA
Wanneer bacteriofagen bacteriën infecteren dan injecteren ze een substantie in de
bacteriën die instrueert om nieuwe faagpartikels aan te maken.
4
,Ze gebruikten radio-isotopen (S35 en P32) die ofwel eiwit ofwel DNA radioactief maken.
- Zwavel 35: wordt ingebouwd in eiwitten (geen zwavel in DNA)
- Fosfor 32: wordt ingebouwd in DNA (geen fosfor in eiwitten)
De gemerkte fagen werden gebruikt om bacteriën te infecteren en vervolgens werden
bacteriën en fagen in een blender van mekaar gescheiden → mengsel van bacteriën en
fagen werd gecentrifugeerd waarbij de lichtere fagen in oplossing bleven & de zwaardere
partikels (bacteriën) gepelleteerd werden.
- Zwavel 35 vond men enkel in de fagen terug
- Fosfor 32 zat volledig in de bacteriën
Bewijs dat DNA de transformerende factor is en
dus de erfelijkheidsdrager is
1.2 Een model voor de structuur van DNA
Erwin Chargaff (1949): de regel van Chargaff
Hij stelde vast dat A,T,C,G niet in gelijke hoeveelheden voorkwamen. Ook vond hij dat de
hoeveelheid A steeds gelijk was aan de hoeveelheid T, terwijl de hoeveelheid C gelijk
was aan G. = Regel van Chargaff
Ratio van A over T & G over C: is bijna overal 1
Purines: A en G
Pyrimidines: C en T
Watson & Crick (1953) modelleerden de correcte structuur van het DNA, de dubbele
helix. Ze gebruikten hiervoor het experiment van Franklin.
1.3 Het centrale dogma
Hoe werd de info in het DNA gebruikt om eiwitten te maken? = Centrale dogma (Crick)
De info in het DNA wordt via een RNA intermediair doorgegeven aan eiwit. DUS:
DNA codeert voor RNA dat op zijn beurt codeert voor een eiwit.
Replicatie = proces waarbij een exacte DNA kopie van de originele DNA matrijs gemaakt
wordt
Transcriptie = proces waarbij DNA wordt gekopieerd naar een enkelstrengig RNA met
dezelfde sequentie als 1 van de DNA strengen. (In dezelfde taal → nucleotiden)
Translatie: proces waarbij RNA nucleotidesequentie wordt omgezet in een eiwit. (in een
andere taal → aminozuren)
5
, 2. De structuur van DNA
2.1 De primaire structuur van DNA
Pentose (suiker) + base + fosfaat
Esterbinding met P-groep : 5’-C
Koppeling van base: 1’-C
DNA: H op 2’
Purines: gekoppeld met 9’-N aan 1’-C op
pentose
Pyrimidines: gekoppeld met 1’-N aan 1’-C
op pentose
Basen: chemische eigenschappen van een
base, zijn niet geprotoneerd bij neutrale pH
Fosfaatgroep: verleent het DNA zijn zure karakter, geeft een sterke negatieve lading aan
DNA
Nomenclatuur:
- base + pentose (zonder fosfaat)= nucleoside
- base + pentose + fosfaat= nucleotide
+ 1 fosfaat= nucleoside monofosfaat
+ 2 fosfaten= nucleoside difosfaat
+ 3 fosfaten= nucleoside trifosfaat
Vorming fosfodiësterbinding:
De OH-groep op de 3’-C van een suiker van het ene
nucleotide zal reageren met de P-groep op de 5’-C van
een suiker van een 2de nucleotide → vorming esterbinding
1 molecule water wordt geëlimineerd en 2 P-groepen
worden vrijgesteld
De binding waarbij suikers van 2 nucleotiden met elkaar
verbonden worden = fosfodiësterbinding (covalent &
stabiel!)
Aan 5’ uiteinde hebben we de P-groep, aan 3’ uiteinde de OH-groep (directionaliteit)
6
Inhoud
1. Grondleggers van de moleculaire biologie ........................................................... 4
1.1 Inzichten in de natuur van het erfelijk materiaal............................................ 4
1.2 Een model voor de structuur van DNA .......................................................... 5
1.3 Het centrale dogma .................................................................................... 5
2. De structuur van DNA ........................................................................................ 6
2.1 De primaire structuur van DNA .................................................................... 6
2.2 De secundaire structuur ............................................................................. 7
2.3 Denaturatie en renaturatie van DNA ............................................................. 8
2.4 De tertiaire structuur .................................................................................. 9
3. Genoomorganisatie en evolutie ........................................................................ 10
3.1 Vele genoomsequenties zijn ontrafeld ........................................................ 10
3.2 Variaties in genoomorganisatie .................................................................. 11
3.3 Eukaryote genomen bevatten veel repetitief DNA ........................................ 12
3.4 Extrachromosomaal DNA en horizontale gentransfer .................................. 14
3.5 Genenclusters.......................................................................................... 16
3.6 Het menselijk genoomproject .................................................................... 17
3.7 Polymorfisme binnen het menselijk genoom .............................................. 17
3.8 Genoomsequenties van hominiden (grote apen) ......................................... 18
3.9 Condensatie van het genoom .................................................................... 18
4. DNA replicatie ................................................................................................. 21
4.1 DNA replicatie is semi-conservatief ........................................................... 21
4.2 DNA replicatie gebeurt meestal bidirectioneel ............................................ 22
4.3 DNA polymerasen katalyseren DNA synthese van 5' naar 3' ......................... 23
4.4 Multi-eiwit moleculaire machines verzorgen DNA replicatie ......................... 24
4.5 Topo-isomerasen relaxeren “supercoiled” DNA........................................... 27
4.6 Specifieke kenmerken van eukaryote DNA replicatie ................................... 28
4.7 Laboratoriumtechnieken gebaseerd op DNA replicatie ................................ 28
4.7.1 Sanger sequenering ........................................................................... 28
5. DNA schade en herstelmechanismen ............................................................... 30
1
, 5.1 Mutaties en DNA schade ................................................................................ 30
5.2 Mutaties op nucleotide niveau ........................................................................ 31
5.3 Structurele beschadiging van de dubbele helix ................................................ 33
5.4 DNA herstelmechanismen ............................................................................. 33
5.4.1 Mismatch-repair ..................................................................................... 33
5.4.2 Base excision repair ................................................................................ 34
5.4.3 Nucleotide excision repair ....................................................................... 35
5.4.4 Non-homologous End Joining (NHEJ) ........................................................ 35
5.4.5 Homologe recombinatie .......................................................................... 36
5.4.6 Geadapteerd CRISPR CAS9 systeem als toolbox om gericht genomische
varianten te introduceren ................................................................................. 37
6. Het ontstaan van genetische variatie ................................................................ 39
6.1 Puntmutaties ........................................................................................... 39
6.2 Genherschikkingen ................................................................................... 40
6.2.1 Transposons...................................................................................... 40
6.2.2 Retrotransposons en retrovirussen ..................................................... 41
6.2.3 Meiose .............................................................................................. 42
6.2.4 Homologe recombinatie..................................................................... 42
6.2.5 Antilichaamdiversiteit: Somatische recombinatie ................................ 45
6.3 Variaties op chromosoomniveau................................................................ 46
6.4 Variaties op genoomniveau ....................................................................... 47
7. Transcriptie en RNA maturatie ............................................................................. 48
7.1 De structuur van RNA .................................................................................... 48
7.2 De boodschapper tussen DNA en eiwit is RNA ................................................. 49
7.3 Basiskenmerken van transcriptie .................................................................... 51
7.4 Transcriptie bij prokaryoten ............................................................................ 52
7.4.1 De promotor ........................................................................................... 52
7.4.2 Het RNA polymerase ............................................................................... 53
7.4.3 Regulatie van transcriptie ........................................................................ 55
7.4.4 Transcriptie terminatie ............................................................................. 57
7.5 Transcriptie bij eukaryoten ............................................................................. 58
7.5.1 Eukaryoten hebben meerdere RNA polymerasen ....................................... 58
2
, 7.5.2 Eukaryote CIS-elementen ........................................................................ 58
7.5.3 Eukaryote TRANS-factoren ....................................................................... 59
7.5.4 DNA condensatie en transcriptionele regulatie .......................................... 64
7.5.5 Transcriptie door RNA polymerase I en III en mitochondriale transcriptie ..... 69
7.5.6 Transcriptie terminatie ............................................................................. 69
7.6 RNA maturatie ............................................................................................... 70
7.6.1 5’ Capping ......................................................................................... 71
7.6.2 3’ Polyadenylatie ............................................................................... 71
7.6.3 mRNA splicing ................................................................................... 72
7.6.4 mRNA editing .................................................................................... 75
7.6.5 mRNA transport ................................................................................. 76
7.6.6 mRNA stabiliteit ................................................................................ 76
7.6.7 RNA interferentie ............................................................................... 77
7.7 rRNA en tRNA maturatie ............................................................................ 81
7.7.1 rRNA maturatie .................................................................................. 81
7.7.2 tRNA maturatie .................................................................................. 82
8. Eiwitsynthese en eiwitadressering .................................................................... 83
8.1 De genetische code gekraakt .......................................................................... 83
8.2 Het ribosoom ................................................................................................ 84
8.3 De eiwitsynthese ........................................................................................... 84
8.3.1 tRNAs en aminoacyl-tRNA synthetasen .................................................... 85
8.3.2 Het translatieproces ................................................................................ 86
8.4 Gereguleerde eiwitafbraak ............................................................................. 91
8.5 Eiwitadressering ............................................................................................ 93
8.5.1 Sortering van eiwitten aangemaakt op vrij ribosomen ................................. 93
8.5.2 Sortering via het ER en Golgi..................................................................... 95
8.5.3 Endocytose en sortering van opgenomen eiwitten ....................................101
8.5.4 Adressering van eiwitten voor lysosomale afbraak ....................................103
3
,1. Grondleggers van de moleculaire biologie
1.1 Inzichten in de natuur van het erfelijk materiaal
Frederick Griffith (1928): het ‘transforming principle’
Experiment met 2 bacteriestammen
- Rough: niet virulent
- Smooth: virulent
1) Muis is dood
2) Muis leeft, maar is ziek; kan bacterie elimineren
3) Muis is dood, heeft uit het bloed een cultuur gemaakt
van levende smooth bacteriën
➔ Genetisch materiaal van dode, virulente bacteriën (S) werd overgedragen op levende,
niet-virulente (R) bacteriën, waardoor deze ziekmakend werden. → de R-stam heeft
een transforming factor.
Avery, McLeod en McCarthy (1944): DNA is het “transforming principle”
- Ze elimineerden eerst vetten en suikers en koken het
mengsel (waardoor bacteriën stierven)
- Er worden in drie buisjes specifieke enzymen
toegevoegd
- Levende R cellen toevoegen en kijken of ze virulent
worden
- Wanneer S cellen behandeld werden met proteasen
of ribonucleasen => wel transformatie naar levende S-
cellen (dus spelen geen rol)
- Transformase gebeurt niet wanneer DNA kapot
gemaakt is
- DNA = transformerende factor MAAR de wetenschap gelooft dit nog niet doordat
men de verkeerde structuur van DNA in gedachten had
- Wat zou een beperking kunnen zijn van het experiment? Je kon niet 100% zeker
zijn dat de enzymen specifiek waren en dat ze dus maar 1 type biomolecule
konden afbreken
Alfred Hershey & Martha Chase (1950)
Experiment met bacteriofagen = virussen die bacteriën infecteren, bestaan enkel uit
eiwit en DNA
Wanneer bacteriofagen bacteriën infecteren dan injecteren ze een substantie in de
bacteriën die instrueert om nieuwe faagpartikels aan te maken.
4
,Ze gebruikten radio-isotopen (S35 en P32) die ofwel eiwit ofwel DNA radioactief maken.
- Zwavel 35: wordt ingebouwd in eiwitten (geen zwavel in DNA)
- Fosfor 32: wordt ingebouwd in DNA (geen fosfor in eiwitten)
De gemerkte fagen werden gebruikt om bacteriën te infecteren en vervolgens werden
bacteriën en fagen in een blender van mekaar gescheiden → mengsel van bacteriën en
fagen werd gecentrifugeerd waarbij de lichtere fagen in oplossing bleven & de zwaardere
partikels (bacteriën) gepelleteerd werden.
- Zwavel 35 vond men enkel in de fagen terug
- Fosfor 32 zat volledig in de bacteriën
Bewijs dat DNA de transformerende factor is en
dus de erfelijkheidsdrager is
1.2 Een model voor de structuur van DNA
Erwin Chargaff (1949): de regel van Chargaff
Hij stelde vast dat A,T,C,G niet in gelijke hoeveelheden voorkwamen. Ook vond hij dat de
hoeveelheid A steeds gelijk was aan de hoeveelheid T, terwijl de hoeveelheid C gelijk
was aan G. = Regel van Chargaff
Ratio van A over T & G over C: is bijna overal 1
Purines: A en G
Pyrimidines: C en T
Watson & Crick (1953) modelleerden de correcte structuur van het DNA, de dubbele
helix. Ze gebruikten hiervoor het experiment van Franklin.
1.3 Het centrale dogma
Hoe werd de info in het DNA gebruikt om eiwitten te maken? = Centrale dogma (Crick)
De info in het DNA wordt via een RNA intermediair doorgegeven aan eiwit. DUS:
DNA codeert voor RNA dat op zijn beurt codeert voor een eiwit.
Replicatie = proces waarbij een exacte DNA kopie van de originele DNA matrijs gemaakt
wordt
Transcriptie = proces waarbij DNA wordt gekopieerd naar een enkelstrengig RNA met
dezelfde sequentie als 1 van de DNA strengen. (In dezelfde taal → nucleotiden)
Translatie: proces waarbij RNA nucleotidesequentie wordt omgezet in een eiwit. (in een
andere taal → aminozuren)
5
, 2. De structuur van DNA
2.1 De primaire structuur van DNA
Pentose (suiker) + base + fosfaat
Esterbinding met P-groep : 5’-C
Koppeling van base: 1’-C
DNA: H op 2’
Purines: gekoppeld met 9’-N aan 1’-C op
pentose
Pyrimidines: gekoppeld met 1’-N aan 1’-C
op pentose
Basen: chemische eigenschappen van een
base, zijn niet geprotoneerd bij neutrale pH
Fosfaatgroep: verleent het DNA zijn zure karakter, geeft een sterke negatieve lading aan
DNA
Nomenclatuur:
- base + pentose (zonder fosfaat)= nucleoside
- base + pentose + fosfaat= nucleotide
+ 1 fosfaat= nucleoside monofosfaat
+ 2 fosfaten= nucleoside difosfaat
+ 3 fosfaten= nucleoside trifosfaat
Vorming fosfodiësterbinding:
De OH-groep op de 3’-C van een suiker van het ene
nucleotide zal reageren met de P-groep op de 5’-C van
een suiker van een 2de nucleotide → vorming esterbinding
1 molecule water wordt geëlimineerd en 2 P-groepen
worden vrijgesteld
De binding waarbij suikers van 2 nucleotiden met elkaar
verbonden worden = fosfodiësterbinding (covalent &
stabiel!)
Aan 5’ uiteinde hebben we de P-groep, aan 3’ uiteinde de OH-groep (directionaliteit)
6
