FLOWCYTOMETRIE
DEEL 1: ANALYTISCHE APPARATUUR EN MEETPRINCIPES
INLEIDING
CD-nummer cluster of differentiation geeft type eiwit weer dit tot expressie komen op bepaalde
cellen hiervan kan celtype afgeleiden worden
Vb.
CD34 = stamcelmerker
CD19 = heel specifieke B-cel merken
Als ze allebei voorkomen kunnen ze kwaadaardig zijn
TERMINOLOGIE
- Parameter
o Fysisch/chemisch kenmerk van de cel (vb.DNA inhoud)
o Fysische eigenschappen van de cel (lichtstrooiing of fluorescentie)
o Intrinsieke/extrinsieke fysische eigenschappen van een reagens geassocieerd met de
cel
- Excitatie Proces waarbij optische energie geabsorbeerd wordt
- Extinctie coefficient (ε)
o Efficiëntie waarmee optische energie geabsorbeerd wordt
o Afhankelijk van golflengte
- Emissie Proces waarbij optische energie terug vrijgesteld wordt
- Quantum opbrengst (Q)
o Efficiëntie waarmee energie wordt vrijgesteld (0-1), meestal als fluorescentie
o Onafhankelijk van golflengte
- Stokes shift Verschil in energie tussen excitatie en emissie golflengte max
o Zorgt ervoor dat we verschillende moleculen met verschillende fluorescentie
karakteristieken kunnen gebruiken, zorgt dat we aan multicolour FCM kunnen doen
- Spectrum Verdeling van excitatie en emissie golflengtes
DEFINITIE
De techniek van flow cytometrie werd ontwikkeld in de jaren ‘70 van de vorige eeuw en is gebaseerd op
de detectie van de lichtverstrooiingssignalen die opgewekt worden ingevolge de snelle passage van
afzonderlijke cellen doorheen een lichtbundel die tot microscopisch kleine dimensie is gefocusseerd
(typische afmeting: ellipsoid intensiteitsprofiel van 20 op 50 μm).
Flow stromen in een vloeibare oplossing
- Wat mogelijk is door de hydrodynamische focusering van de celsuspensiestroom in een
laminaire geleidingsvloeistifstroom
Cyto cel
- Van afzonderlijke cellen doorheen het centrum van een, tot een microscopisch kleine spot
gefocusseerde lichtstraal
,Metrie meten
- Dectie van lichtsignalen, opgewekt ten gevolge van de snelle doorgang
FLOWCYTOMETRIE = het meten van fysische en chemische eigenschappen van cellen in een constante
stroom
Hoe gaat het tewerk
De flowcytometer werkt door een laserstraal te richten op individuele cellen die door een meetpunt
stromen. Een "optische vingerafdruk" wordt gegenereerd voor elke cel binnen een heterogene
populatie als deze door de bundel gaat. Wanneer cellen gelabeld zijn met fluorescerende probes,
kunnen verschillende parameters van elke cel tegelijkertijd bepaald worden. Aangezien de cellen snel
worden ondervraagd, kunnen gegevens en duizenden cellen in seconden worden verkregen.
METEN VAN INDIVIDUELE CELLEN
Elk partikel of cel in oplossing met een grootte van 0.2 – 150 μm is geschikt voor flowcytometrische
analyse
Bepaalde cellen zijn uitermate geschikt voor FCM = Leukocyten in bloed
In tegenstelling tot solide tumoren en andere weefsels zijn er disaggregatie-protocols om als een
singel cel voor te komen dit kan op 2 manieren gebeuren
- Enzymatisch
o Collagenase
- Mechanisch + filteren
Als de stroom veel breder is kan er veel cellen
voorbij komen maar niet alle cellen gaan daardoor
goed kunnen bestraald worden
Er zijn 2 belangrijke voorwaarden
1. Cellen bevinden zich altijd in een singel cel suspensie = cellen moeten zich individueel
bevinden + in oplossing
o Niet meer in geaggregeerde vorm
bv: bloed bevinden zich al in single cell suspensie / Leukocyten in het bloed zijn uitermate
geschikt omdat ze zich al in single cell suspensie bevinden / weefselbiopt minder geschikt
eerst disaggregatie nodig om individuele cellen te verkrijgen
2. Celstroom wordt hydrodynamische gefocusseerd
HYDRODYNAMISCHE FOCUSSERING
Vertrekkende van een celsuspensie, de cellen één na één doorheen de lichtbundelfocus te sturen
baseert men zich op het door Crosland-Taylor in ontwikkeld principe van de hydrodynamische
, focussering van de celsuspensiestroom in een -onder laminaire condities stromende-
geleidingsvloeistofstroom
De laminaire condities werden bepaald door het Reynolds getal Re = drn/h
d = diameter ρ = dichtheid van de vloeistof v= gemiddelde snelheid van de vloeistof η = viscositeit van
de vloeistof
Als het Reynolds getal < 2300 = laminaire stroom als het > 2300 = turbulente stroom (cellen kunnen niet
een per een gealigneerd worden)
Op die manier worden de cellen op één lijn gelijkgericht in de tot microscopische afmetingen versmalde
celsuspensie-stroom die aan een snelheid van ~10 m/sec precies gericht wordt doorheen de
lichtbundelfocus
ANATOMIE VAN DE FCM
Het apparatuur bestaat uit 3 onderdelen:
FLUIDICS
= vloeistof gedeelte transport van partikels naar de lichtbron cellen worden aangestraald om een
lichtsignaal te veroorzaken. Deze licht signalen worden gegenereerd en gecapteerd door het optische
systeem
Onderdelen
- Flowcel
- Staal
- Sheath tank bevat geleidingsvloeistof
Voor een optimale aanstraling is het belangrijk dat de stroom die de partiekels transporteert centraal in
de laserstraal gepositioneerd zijn slechts 1 cel/partikel tegelijk door de laserstraat
DEEL 1: ANALYTISCHE APPARATUUR EN MEETPRINCIPES
INLEIDING
CD-nummer cluster of differentiation geeft type eiwit weer dit tot expressie komen op bepaalde
cellen hiervan kan celtype afgeleiden worden
Vb.
CD34 = stamcelmerker
CD19 = heel specifieke B-cel merken
Als ze allebei voorkomen kunnen ze kwaadaardig zijn
TERMINOLOGIE
- Parameter
o Fysisch/chemisch kenmerk van de cel (vb.DNA inhoud)
o Fysische eigenschappen van de cel (lichtstrooiing of fluorescentie)
o Intrinsieke/extrinsieke fysische eigenschappen van een reagens geassocieerd met de
cel
- Excitatie Proces waarbij optische energie geabsorbeerd wordt
- Extinctie coefficient (ε)
o Efficiëntie waarmee optische energie geabsorbeerd wordt
o Afhankelijk van golflengte
- Emissie Proces waarbij optische energie terug vrijgesteld wordt
- Quantum opbrengst (Q)
o Efficiëntie waarmee energie wordt vrijgesteld (0-1), meestal als fluorescentie
o Onafhankelijk van golflengte
- Stokes shift Verschil in energie tussen excitatie en emissie golflengte max
o Zorgt ervoor dat we verschillende moleculen met verschillende fluorescentie
karakteristieken kunnen gebruiken, zorgt dat we aan multicolour FCM kunnen doen
- Spectrum Verdeling van excitatie en emissie golflengtes
DEFINITIE
De techniek van flow cytometrie werd ontwikkeld in de jaren ‘70 van de vorige eeuw en is gebaseerd op
de detectie van de lichtverstrooiingssignalen die opgewekt worden ingevolge de snelle passage van
afzonderlijke cellen doorheen een lichtbundel die tot microscopisch kleine dimensie is gefocusseerd
(typische afmeting: ellipsoid intensiteitsprofiel van 20 op 50 μm).
Flow stromen in een vloeibare oplossing
- Wat mogelijk is door de hydrodynamische focusering van de celsuspensiestroom in een
laminaire geleidingsvloeistifstroom
Cyto cel
- Van afzonderlijke cellen doorheen het centrum van een, tot een microscopisch kleine spot
gefocusseerde lichtstraal
,Metrie meten
- Dectie van lichtsignalen, opgewekt ten gevolge van de snelle doorgang
FLOWCYTOMETRIE = het meten van fysische en chemische eigenschappen van cellen in een constante
stroom
Hoe gaat het tewerk
De flowcytometer werkt door een laserstraal te richten op individuele cellen die door een meetpunt
stromen. Een "optische vingerafdruk" wordt gegenereerd voor elke cel binnen een heterogene
populatie als deze door de bundel gaat. Wanneer cellen gelabeld zijn met fluorescerende probes,
kunnen verschillende parameters van elke cel tegelijkertijd bepaald worden. Aangezien de cellen snel
worden ondervraagd, kunnen gegevens en duizenden cellen in seconden worden verkregen.
METEN VAN INDIVIDUELE CELLEN
Elk partikel of cel in oplossing met een grootte van 0.2 – 150 μm is geschikt voor flowcytometrische
analyse
Bepaalde cellen zijn uitermate geschikt voor FCM = Leukocyten in bloed
In tegenstelling tot solide tumoren en andere weefsels zijn er disaggregatie-protocols om als een
singel cel voor te komen dit kan op 2 manieren gebeuren
- Enzymatisch
o Collagenase
- Mechanisch + filteren
Als de stroom veel breder is kan er veel cellen
voorbij komen maar niet alle cellen gaan daardoor
goed kunnen bestraald worden
Er zijn 2 belangrijke voorwaarden
1. Cellen bevinden zich altijd in een singel cel suspensie = cellen moeten zich individueel
bevinden + in oplossing
o Niet meer in geaggregeerde vorm
bv: bloed bevinden zich al in single cell suspensie / Leukocyten in het bloed zijn uitermate
geschikt omdat ze zich al in single cell suspensie bevinden / weefselbiopt minder geschikt
eerst disaggregatie nodig om individuele cellen te verkrijgen
2. Celstroom wordt hydrodynamische gefocusseerd
HYDRODYNAMISCHE FOCUSSERING
Vertrekkende van een celsuspensie, de cellen één na één doorheen de lichtbundelfocus te sturen
baseert men zich op het door Crosland-Taylor in ontwikkeld principe van de hydrodynamische
, focussering van de celsuspensiestroom in een -onder laminaire condities stromende-
geleidingsvloeistofstroom
De laminaire condities werden bepaald door het Reynolds getal Re = drn/h
d = diameter ρ = dichtheid van de vloeistof v= gemiddelde snelheid van de vloeistof η = viscositeit van
de vloeistof
Als het Reynolds getal < 2300 = laminaire stroom als het > 2300 = turbulente stroom (cellen kunnen niet
een per een gealigneerd worden)
Op die manier worden de cellen op één lijn gelijkgericht in de tot microscopische afmetingen versmalde
celsuspensie-stroom die aan een snelheid van ~10 m/sec precies gericht wordt doorheen de
lichtbundelfocus
ANATOMIE VAN DE FCM
Het apparatuur bestaat uit 3 onderdelen:
FLUIDICS
= vloeistof gedeelte transport van partikels naar de lichtbron cellen worden aangestraald om een
lichtsignaal te veroorzaken. Deze licht signalen worden gegenereerd en gecapteerd door het optische
systeem
Onderdelen
- Flowcel
- Staal
- Sheath tank bevat geleidingsvloeistof
Voor een optimale aanstraling is het belangrijk dat de stroom die de partiekels transporteert centraal in
de laserstraal gepositioneerd zijn slechts 1 cel/partikel tegelijk door de laserstraat
