Forensische genetica
1. DNA-extractie methoden
DNA-extractie omvat het scheiden van de nucleïnezuren in een cel van de eiwitten en andere cellulaire
materialen. Soms wordt filtratie na extractie toegepast om lage hoeveelheden hersteld DNA te concentreren.
Bij elke DNA-extractietechniek is het belangrijk om zoveel mogelijk stoffen te verwijderen die interferentie
kunnen veroorzaken bij latere tests en de afbraak van de geëxtraheerde DNA-molecule na verloop van tijd
kunnen bevorderen.
Doel van DNA-isolatie
DNA scheiden van andere cellulaire moleculen en niet-cellulaire componenten
- Eiwitten en vetzuren
- Enzymen: DNases
- Chemische stoffen in kleding Eigen aan forensische biologische sporen: geen
- Metaalionen in silicium (zand) zuivere cellen
Verwijderen van potentiële inhibitoren:
“downstream reacties” (PCR)
- Hemoglobine in bloed
- Melanine in haren
- Chemische stoffen in kleding: bijv. denim
Preventie van verdere degradatie van het DNA: niet alleen de DNase die aanwezig zijn, maar ook
bacteriën die in de omgeving aanwezig zijn.
Weinig celmateriaal: concentratie van het DNA in een klein volume
Alle monsters moeten zorgvuldig worden gehandeld, ongeacht de gebruikte DNA-extractiemethode, om
besmetting van monster tot monster of de introductie van vreemd DNA te voorkomen. De extractie is
waarschijnlijk het moment waarop het DNA-monster het meest vatbaar is voor besmetting in het labo.
Geëxtraheerd DNA: opgeslagen bij -20°C of -80°C (langdurige opslag)
Activiteit van nucleasen voorkomen (breken DNA af om de cel in staat te stellen nucleotiden te
recycleren).
- Hebben magnesium nodig om goed te functioneren → EDTA tube gebruiken.
• Bindt aan het meeste vrije magnesium en voorkomt dat de nucleasen het DNA in het
verzamelde bloedmonster vernietigen.
1.1 DNA-isolatie: klassieke methoden.
De extractie- of DNA-isolatieprocedure varieert afhankelijk van het type biologisch bewijs dat wordt onderzocht.
, Organische extractie Chelex FTA
Snel
Snel Mogelijkheid voor
Goedkoop automatisatie
Voordelen
Bewezen methodologie Minder kans op de Minder kans op de
introductie van introductie van
contaminatie contaminatie
Bewaring van stalen
Gebruik van toxische organische stoffen
Tijdrovende procedure: veel transfers
Verlies van DNA
Nadelen
Kans op introductie van contaminatie Enkel voor referentiestalen
Chelex kan voor
inhibitie zorgen in PCR
Kans op verlies van DNA
Geen automatisatie
Huidcontact sporen bevatten ook heel veel celvrij DNA → na het afdraaien verlies van DNA (bij chelex)
1.1.1 Organische (fenol-chloroform) extractie.
Organische (fenol-chloroformextractie) wordt het langste gebruikt.
DNA met hoog moleculair gewicht kan het meest effectief worden verkregen met organische extractie.
Organische extractie omvat de seriële toevoeging van verschillende chemicaliën.
SDS (natriumdodecylsulfaat) + proteïnase K: celmembranen open te breken en de eiwitten af te breken
die het DNA beschermen.
, Fenol/chloroformmengsel: eiwitten van het DNA te scheiden
- DNA lost beter op in het waterige gedeelte van het organisch-waterige mengsel
Na centrifuge worden de ongewenste eiwitten en de cellulaire resten gescheiden van de waterige fase.
- Dubbelstrengige DNA-moleculen worden overgebracht voor verdere analyse.
1.1.2 Chelex-extractie.
Alternatieve en kosteneffectieve methode voor DNA-extractie, gebruik van een chelerende harssuspensie die
direct aan het monster kan worden toegevoegd (bijv. bloed, bloedvlek of sperma).
Sneller dan de organische extractiemethode & minder stappen, wat het risico op besmetting van het
monster vermindert.
Chelex bestaat uit styreen-divinylbenzeen copolymeren met gepaarde iminodiacetaat-ionen die fungeren als
chelerende groepen bij het binden van meerwaardige metaalionen, bijv. magnesium.
Door magnesium uit de reactie te verwijderen, worden DNA-vernietigende nuclease-enzymen
geïnactiveerd en worden de DNA-moleculen beschermd.
Aan biologische monsters, bijv. bloedvlekken, wordt een 5% Chelex-suspensie toegevoegd en enkele minuten
gekookt: cellen open breken en het DNA vrij te maken.
Voorafgaande wasstap kan nuttig zijn om verontreinigingen en remmers te verwijderen.
Blootstelling aan 100%: denaturatie van DNA → breekt celmembranen af en vernietigt de celeiwitten.
Korte centrifugatie, waarbij Chelex-hars en cellulaire resten naar de bodem van het buisje worden
getrokken, wordt de supernatants verwijderd en kan deze direct worden toegevoegd aan de PCR-
amplificatiereactie.
Chelex denatureert dubbelstrengig DNA → enkelstrengig DNA uit het extractieproces
Alleen PCR-gebaseerde analyses zijn mogelijk!
- Voordelen voor PCR-gebaseerde typeringsmethoden, omdat het remmers van PCR verwijderd
en slechts één buisje voor DNA-extractie gebruikt
• Vermindert risico op labo-geïnduceerde besmetting.
1.1.3 FTA-papier
FTA-papier is een absorberend, cellulose-gebaseerd papier dat vier chemische stoffen bevat om DNA-
moleculen te beschermen tegen nuclease-afbraak en het papier zelf tegen bacteriegroei.
DNA op FTA-papier blijft jarenlang stabiel bij kamertemperatuur.
Druppel bloed op het papier, waarna de vlek droogt.
Cellen worden bij contact met het papier afgebroken, en DNA uit de witte bloedcellen wordt binnen de
papiermatrix geïmmobiliseerd.
1. DNA-extractie methoden
DNA-extractie omvat het scheiden van de nucleïnezuren in een cel van de eiwitten en andere cellulaire
materialen. Soms wordt filtratie na extractie toegepast om lage hoeveelheden hersteld DNA te concentreren.
Bij elke DNA-extractietechniek is het belangrijk om zoveel mogelijk stoffen te verwijderen die interferentie
kunnen veroorzaken bij latere tests en de afbraak van de geëxtraheerde DNA-molecule na verloop van tijd
kunnen bevorderen.
Doel van DNA-isolatie
DNA scheiden van andere cellulaire moleculen en niet-cellulaire componenten
- Eiwitten en vetzuren
- Enzymen: DNases
- Chemische stoffen in kleding Eigen aan forensische biologische sporen: geen
- Metaalionen in silicium (zand) zuivere cellen
Verwijderen van potentiële inhibitoren:
“downstream reacties” (PCR)
- Hemoglobine in bloed
- Melanine in haren
- Chemische stoffen in kleding: bijv. denim
Preventie van verdere degradatie van het DNA: niet alleen de DNase die aanwezig zijn, maar ook
bacteriën die in de omgeving aanwezig zijn.
Weinig celmateriaal: concentratie van het DNA in een klein volume
Alle monsters moeten zorgvuldig worden gehandeld, ongeacht de gebruikte DNA-extractiemethode, om
besmetting van monster tot monster of de introductie van vreemd DNA te voorkomen. De extractie is
waarschijnlijk het moment waarop het DNA-monster het meest vatbaar is voor besmetting in het labo.
Geëxtraheerd DNA: opgeslagen bij -20°C of -80°C (langdurige opslag)
Activiteit van nucleasen voorkomen (breken DNA af om de cel in staat te stellen nucleotiden te
recycleren).
- Hebben magnesium nodig om goed te functioneren → EDTA tube gebruiken.
• Bindt aan het meeste vrije magnesium en voorkomt dat de nucleasen het DNA in het
verzamelde bloedmonster vernietigen.
1.1 DNA-isolatie: klassieke methoden.
De extractie- of DNA-isolatieprocedure varieert afhankelijk van het type biologisch bewijs dat wordt onderzocht.
, Organische extractie Chelex FTA
Snel
Snel Mogelijkheid voor
Goedkoop automatisatie
Voordelen
Bewezen methodologie Minder kans op de Minder kans op de
introductie van introductie van
contaminatie contaminatie
Bewaring van stalen
Gebruik van toxische organische stoffen
Tijdrovende procedure: veel transfers
Verlies van DNA
Nadelen
Kans op introductie van contaminatie Enkel voor referentiestalen
Chelex kan voor
inhibitie zorgen in PCR
Kans op verlies van DNA
Geen automatisatie
Huidcontact sporen bevatten ook heel veel celvrij DNA → na het afdraaien verlies van DNA (bij chelex)
1.1.1 Organische (fenol-chloroform) extractie.
Organische (fenol-chloroformextractie) wordt het langste gebruikt.
DNA met hoog moleculair gewicht kan het meest effectief worden verkregen met organische extractie.
Organische extractie omvat de seriële toevoeging van verschillende chemicaliën.
SDS (natriumdodecylsulfaat) + proteïnase K: celmembranen open te breken en de eiwitten af te breken
die het DNA beschermen.
, Fenol/chloroformmengsel: eiwitten van het DNA te scheiden
- DNA lost beter op in het waterige gedeelte van het organisch-waterige mengsel
Na centrifuge worden de ongewenste eiwitten en de cellulaire resten gescheiden van de waterige fase.
- Dubbelstrengige DNA-moleculen worden overgebracht voor verdere analyse.
1.1.2 Chelex-extractie.
Alternatieve en kosteneffectieve methode voor DNA-extractie, gebruik van een chelerende harssuspensie die
direct aan het monster kan worden toegevoegd (bijv. bloed, bloedvlek of sperma).
Sneller dan de organische extractiemethode & minder stappen, wat het risico op besmetting van het
monster vermindert.
Chelex bestaat uit styreen-divinylbenzeen copolymeren met gepaarde iminodiacetaat-ionen die fungeren als
chelerende groepen bij het binden van meerwaardige metaalionen, bijv. magnesium.
Door magnesium uit de reactie te verwijderen, worden DNA-vernietigende nuclease-enzymen
geïnactiveerd en worden de DNA-moleculen beschermd.
Aan biologische monsters, bijv. bloedvlekken, wordt een 5% Chelex-suspensie toegevoegd en enkele minuten
gekookt: cellen open breken en het DNA vrij te maken.
Voorafgaande wasstap kan nuttig zijn om verontreinigingen en remmers te verwijderen.
Blootstelling aan 100%: denaturatie van DNA → breekt celmembranen af en vernietigt de celeiwitten.
Korte centrifugatie, waarbij Chelex-hars en cellulaire resten naar de bodem van het buisje worden
getrokken, wordt de supernatants verwijderd en kan deze direct worden toegevoegd aan de PCR-
amplificatiereactie.
Chelex denatureert dubbelstrengig DNA → enkelstrengig DNA uit het extractieproces
Alleen PCR-gebaseerde analyses zijn mogelijk!
- Voordelen voor PCR-gebaseerde typeringsmethoden, omdat het remmers van PCR verwijderd
en slechts één buisje voor DNA-extractie gebruikt
• Vermindert risico op labo-geïnduceerde besmetting.
1.1.3 FTA-papier
FTA-papier is een absorberend, cellulose-gebaseerd papier dat vier chemische stoffen bevat om DNA-
moleculen te beschermen tegen nuclease-afbraak en het papier zelf tegen bacteriegroei.
DNA op FTA-papier blijft jarenlang stabiel bij kamertemperatuur.
Druppel bloed op het papier, waarna de vlek droogt.
Cellen worden bij contact met het papier afgebroken, en DNA uit de witte bloedcellen wordt binnen de
papiermatrix geïmmobiliseerd.
