Samenvatting Biochemie
Week 1: homogeniseren, fractioneren en dialyseren
Homogeniseren is de eerste stap van de eiwitzuivering. Het is het proces van meer gelijke
deeltjesgrootte te krijgen van substanties. In dit
geval gaat het om lyseren (‘kapot maken’) van
cellen.
- Osmotische schok; celmembraan kapot
door zwelling cel in de hypotone
oplossing. De osmotische waarde wordt
sterk verhoogd of verlaagd, de cel neemt
water op, de celwand en het
celmembraan kan dan de druk niet meer
aan het knapt kapot.
- ‘Freeze/thaw’; vriezen en dooien, zodra je iets snel gaat invriezen en dit vervolgens
gaat ontdooien, vormt het ijs als het kristaliseert een 3D-structuur en zwelt het
cytoplasma op waardoor het celmembraan breekt.
- Enzymatisch (als er een celwand is); enzymen breken de celwand af. De celwand
wordt kapot gemaakt, de cel verliest dan zijn weerstand en dan komt er osmotische
druk.
- Detergentia; het celmembraan lost op in detergentia. Hierbij moet je oppassen dat
het eiwit van interesse niet kapot gaat.
Methode kiezen dat past bij het type cel of weefsel. Rekening houden met isoleren van
specifieke organellen/celonderelen
Homogenistatie methodes:
- “Potter Elvehjem” of “dounchen”
o Mild: Organellen blijven intact
- Vermalen met zand- /glaskorrels
o Gistcellen kapot maken
- Mortier en vijzel; cellen in een kommetje die gaan kapot door de fysieke druk van het
malen.
o Kleine hoeveelheden bevroren materiaal
- “French Press”; grote container met een vat dat druk aankan celsuspensie gaat
daarin en ga je veel druk op uitoefenen. Er zit een gaatje in dat alles onder hoge druk
door het kleine gaatje past, cel kan de druk niet reguleren en knapt open.
o Goed voor grote volumes
- Blender
o Organen en weefsels
- Ultrasoon trillen; badje waarbij er een trilplaat is of je voegt een trillende pin toe, er
ontstaan dan druk golven die ervoor zorgen dat er een hoge druk is, als er bij de cel
een lage druk is knapt de cel door het drukverschil. Sonificatie
o Goed voor kleine bacterieculturen
Fractioneren is stap 2 van het zuiveren, het is het scheiden van alles in verschillende fracties.
Door zwaartekracht zakken de zwaardere deeltjes sneller naar beneden, je oefent een kracht
,uit op de deeltjes, dit gaat met een constante snelheid van de ene kant naar de andere kant
van de buis. Dit doe je door centrifugeren, daarvoor zijn 3 methodes:
- Zone dichtheid: vooraf ingestelde dichtheids gradient, de dichtheid is normaal
gesproken lager dan de deeltjes die je wilt gaan scheiden. Scheidt in verschillende
zones over tijd
- Iso picnischs: tijdens centrifugeren wordt de dichtheid gradient toegevoegd.
Dichtheid is gelijk en groter dan de deeltjes die je wilt gaan scheiden. Dichtheid van je
deeltje is uiteindelijk kleiner dan de dichtheid op het einde van de buis.
- Differentiële centrifugatie: scheiden door verschillende centrifuge tijden en snelheid
variëren. Alle deeltjes worden versneld en door de wrijvingskracht worden ze
teruggedrukt, hoe sneller hoe meer kracht. Hoe stroperiger het deeltje is hoe
langzamer het deeltje gaat. Er wordt dus gebruikt gemaakt van het verschil in
dichtheid van het deeltje en de vloeistof.
- Je hebt je cellen kapot gemaakt, membranen zijn kapot maar bevatten nog
wel organellen. Alle deeltjes hebben een verschillende dichtheid en diameter,
en zo kun je centrifugeren bij verschillende dichtheiden en snelheden. Pellet
(vast onder in de buis). Je begint langzaam te draaien en steeds sneller, de
vloeibare fase giet je af (supernatant) pellet hou je over. 1 van die kun je weer
gebruiken. Verschil in sedimentatie dichtheid (de snelheid waarbij deeltjes
effectief naar beneden gaan). (dichtheid van een deeltje groter dan dichtheid
van de oplossing.)
Differentiele centrifugatie Zone dichtheidsgradiënt- Isopycnische
centrifugatie
• Verschillende • Scheiden op verschil in • Scheiden op verschil
fractie gescheiden bewegingssnelheid in dichtheid
bij verschillende • Massa • Onafhankelijk van
centrifuge • Diameter/vorm de tijd
snelheden • Tijd afhankelijk • Dichtheidsgradiënt
• Grootte van • Vooraf gevormd medium vormt
deeltje/diameter medium van bijv. tijdens centrifugatie
• Vorm deeltje sucrose (suiker) (cesium chloride
(globulair, • Dunne zone sample (CsCl))
cilindrisch) bovenop • Homogeen mengsel
• Viscositeit vloeistof • Scheidt in scheidt in laagjes
(stroperigheid) verschillende zones van verschillende
• Verschil dichtheid over tijd dichtheid
van deeltje en
vloeistof
Lineaire gradiënt: gradiënt loopt geleidelijk op. 1e bak = hoge dichtheid – 2e bak = lage
dichtheid (stabiel door toevoeging 1e bak)
Discontinue gradiënt: gradiënt loopt in stappen op. Diffusie +- 3 uur, gradiënt in buis, daarna
dichtheid vergroten.
Fractioneren – precipiteren uitzouten.
Precipiteren door stoffen toe te voegen dat dingen neerslaan en dingen in oplossing houdt.
, Uitzouten en uitzuren. Zout voor uitzouten is ammoniumzout, goed oplosbaar in hoge
concentraties en het heeft weinig interacties met je eiwit zelf, het maakt niet zoveel kapot.
Als een stof in oplossing zit gaan de watermoleculen een interactie aan met de moleculen.
Dan vormt er een watermantel op de molecuul heen (hydratieschil), die zorgt ervoor dat de
moleculen afzonderlijk van elkaar kunnen leven. Als je zout oplost in water vallen de ionen
uit elkaar en krijgen die ook een mantel. Als je dus veel zout oplost krijg je veel ionen die
allemaal een mantel hebben. De ionen pakken de hydratie moleculen van de eiwitten en die
gaan om de ionen zitten. Dus eiwitmoleculen met een lage hoeveelheid polaire en geladen
groepen, kunnen minder interacties aangaan. Grote lading dichtheid en polariteit, meer zout
toevoegen om water moleculen weg te halen van de eiwitten. Als de eiwitten geen schil
meer hebben komen ze elkaar weer tegen dus gaan ze aan elkaar plakken en krijg je
samenklontering van eiwitten en slaan ze neer.
Stappen eiwitzuivering: homogeniseren & extractie centrifugeren precipitatie
(fractionering) membraanfiltratie chromotografie.
Soms gaat de oplosbaarheid van eiwitten omhoog als je zout toevoegt (inzouten (eiwitten
lossen beter op bij een lage zouconcentratie) Dat heeft ergens een maximum. Als je dan
meer zout er aan toevoegd, ga je uitzouten,
280nm, peptidebindingen absorberen een beetje, tryptofaan en tyrosine absorberen heel
goed bij 280nm. Als je eiwit dat veel heeft, kun je goed meten hoeveel eiwit je in je oplossing
hebt. Als je ammoniumsulfaat toevoegd, ga je van 1000 naar 600 totaal eiwit. Een groot deel
ben je dan al kwijt. Je enzymactiviteit neemt niet af, die blijft gelijk en zit dus netjes nog in
oplossing. Na toevoeging van meer zout, ben je het meeste eiwit kwijt, klein beetje van
enzymactiviteit gaat verloren.
Je kunt ook uitzuren. Kan op 2 manieren:
- Je trekt hydratiemantel weg (uitzouten (eiwitten
lossen minder goed op bij te hoge zoutconcentratie)
- Je veranderdt de pH, omeving veranderd en
ladingstoestand dus ook
- Als je de pH zuur genoeg maakt, alle zuurgroepen
protoneren, basen ook. Alle negatieve ladingen vallen
weg, alles positieve ladingen blijven positief, geen
interacties meer en structuur wordt verbroken.
Waardoor eiwit meer klontert.
- TCA slaat wel neer maar raakt niet gedenatureert.
Boven isoelektrisch punt: eiwit oppervlak negatief geladen.
Totale lading eiwit : negatief Isoelektrisch punt : 0. Onder pH
van elektrisch punt: positief geladen oppervlak.
Lage pH: kun je eiwit er totaal uithalen, geen functioneel eiwit meer iso elektrisch
precipitatie.
Coprecipitatie = neerslag van stoffen die normaal oplosbaar zijn.
Sommige eiwitten zitten aan celmembranen, of zitten erdoorheen. Transmembraan eiwitten
2 hydrofobe benen, en hydrofiele kop. De benen zitten bij elkaar en de kopjes gaan bij
water zitten. Aan de onderkant zit een vlak waar de beentjes bij elkaar zitten van de lagen.
Daaronder zit weer water waar die kopjes weer aangaan. Binnenkant is dus apolair. Eiwit is
Week 1: homogeniseren, fractioneren en dialyseren
Homogeniseren is de eerste stap van de eiwitzuivering. Het is het proces van meer gelijke
deeltjesgrootte te krijgen van substanties. In dit
geval gaat het om lyseren (‘kapot maken’) van
cellen.
- Osmotische schok; celmembraan kapot
door zwelling cel in de hypotone
oplossing. De osmotische waarde wordt
sterk verhoogd of verlaagd, de cel neemt
water op, de celwand en het
celmembraan kan dan de druk niet meer
aan het knapt kapot.
- ‘Freeze/thaw’; vriezen en dooien, zodra je iets snel gaat invriezen en dit vervolgens
gaat ontdooien, vormt het ijs als het kristaliseert een 3D-structuur en zwelt het
cytoplasma op waardoor het celmembraan breekt.
- Enzymatisch (als er een celwand is); enzymen breken de celwand af. De celwand
wordt kapot gemaakt, de cel verliest dan zijn weerstand en dan komt er osmotische
druk.
- Detergentia; het celmembraan lost op in detergentia. Hierbij moet je oppassen dat
het eiwit van interesse niet kapot gaat.
Methode kiezen dat past bij het type cel of weefsel. Rekening houden met isoleren van
specifieke organellen/celonderelen
Homogenistatie methodes:
- “Potter Elvehjem” of “dounchen”
o Mild: Organellen blijven intact
- Vermalen met zand- /glaskorrels
o Gistcellen kapot maken
- Mortier en vijzel; cellen in een kommetje die gaan kapot door de fysieke druk van het
malen.
o Kleine hoeveelheden bevroren materiaal
- “French Press”; grote container met een vat dat druk aankan celsuspensie gaat
daarin en ga je veel druk op uitoefenen. Er zit een gaatje in dat alles onder hoge druk
door het kleine gaatje past, cel kan de druk niet reguleren en knapt open.
o Goed voor grote volumes
- Blender
o Organen en weefsels
- Ultrasoon trillen; badje waarbij er een trilplaat is of je voegt een trillende pin toe, er
ontstaan dan druk golven die ervoor zorgen dat er een hoge druk is, als er bij de cel
een lage druk is knapt de cel door het drukverschil. Sonificatie
o Goed voor kleine bacterieculturen
Fractioneren is stap 2 van het zuiveren, het is het scheiden van alles in verschillende fracties.
Door zwaartekracht zakken de zwaardere deeltjes sneller naar beneden, je oefent een kracht
,uit op de deeltjes, dit gaat met een constante snelheid van de ene kant naar de andere kant
van de buis. Dit doe je door centrifugeren, daarvoor zijn 3 methodes:
- Zone dichtheid: vooraf ingestelde dichtheids gradient, de dichtheid is normaal
gesproken lager dan de deeltjes die je wilt gaan scheiden. Scheidt in verschillende
zones over tijd
- Iso picnischs: tijdens centrifugeren wordt de dichtheid gradient toegevoegd.
Dichtheid is gelijk en groter dan de deeltjes die je wilt gaan scheiden. Dichtheid van je
deeltje is uiteindelijk kleiner dan de dichtheid op het einde van de buis.
- Differentiële centrifugatie: scheiden door verschillende centrifuge tijden en snelheid
variëren. Alle deeltjes worden versneld en door de wrijvingskracht worden ze
teruggedrukt, hoe sneller hoe meer kracht. Hoe stroperiger het deeltje is hoe
langzamer het deeltje gaat. Er wordt dus gebruikt gemaakt van het verschil in
dichtheid van het deeltje en de vloeistof.
- Je hebt je cellen kapot gemaakt, membranen zijn kapot maar bevatten nog
wel organellen. Alle deeltjes hebben een verschillende dichtheid en diameter,
en zo kun je centrifugeren bij verschillende dichtheiden en snelheden. Pellet
(vast onder in de buis). Je begint langzaam te draaien en steeds sneller, de
vloeibare fase giet je af (supernatant) pellet hou je over. 1 van die kun je weer
gebruiken. Verschil in sedimentatie dichtheid (de snelheid waarbij deeltjes
effectief naar beneden gaan). (dichtheid van een deeltje groter dan dichtheid
van de oplossing.)
Differentiele centrifugatie Zone dichtheidsgradiënt- Isopycnische
centrifugatie
• Verschillende • Scheiden op verschil in • Scheiden op verschil
fractie gescheiden bewegingssnelheid in dichtheid
bij verschillende • Massa • Onafhankelijk van
centrifuge • Diameter/vorm de tijd
snelheden • Tijd afhankelijk • Dichtheidsgradiënt
• Grootte van • Vooraf gevormd medium vormt
deeltje/diameter medium van bijv. tijdens centrifugatie
• Vorm deeltje sucrose (suiker) (cesium chloride
(globulair, • Dunne zone sample (CsCl))
cilindrisch) bovenop • Homogeen mengsel
• Viscositeit vloeistof • Scheidt in scheidt in laagjes
(stroperigheid) verschillende zones van verschillende
• Verschil dichtheid over tijd dichtheid
van deeltje en
vloeistof
Lineaire gradiënt: gradiënt loopt geleidelijk op. 1e bak = hoge dichtheid – 2e bak = lage
dichtheid (stabiel door toevoeging 1e bak)
Discontinue gradiënt: gradiënt loopt in stappen op. Diffusie +- 3 uur, gradiënt in buis, daarna
dichtheid vergroten.
Fractioneren – precipiteren uitzouten.
Precipiteren door stoffen toe te voegen dat dingen neerslaan en dingen in oplossing houdt.
, Uitzouten en uitzuren. Zout voor uitzouten is ammoniumzout, goed oplosbaar in hoge
concentraties en het heeft weinig interacties met je eiwit zelf, het maakt niet zoveel kapot.
Als een stof in oplossing zit gaan de watermoleculen een interactie aan met de moleculen.
Dan vormt er een watermantel op de molecuul heen (hydratieschil), die zorgt ervoor dat de
moleculen afzonderlijk van elkaar kunnen leven. Als je zout oplost in water vallen de ionen
uit elkaar en krijgen die ook een mantel. Als je dus veel zout oplost krijg je veel ionen die
allemaal een mantel hebben. De ionen pakken de hydratie moleculen van de eiwitten en die
gaan om de ionen zitten. Dus eiwitmoleculen met een lage hoeveelheid polaire en geladen
groepen, kunnen minder interacties aangaan. Grote lading dichtheid en polariteit, meer zout
toevoegen om water moleculen weg te halen van de eiwitten. Als de eiwitten geen schil
meer hebben komen ze elkaar weer tegen dus gaan ze aan elkaar plakken en krijg je
samenklontering van eiwitten en slaan ze neer.
Stappen eiwitzuivering: homogeniseren & extractie centrifugeren precipitatie
(fractionering) membraanfiltratie chromotografie.
Soms gaat de oplosbaarheid van eiwitten omhoog als je zout toevoegt (inzouten (eiwitten
lossen beter op bij een lage zouconcentratie) Dat heeft ergens een maximum. Als je dan
meer zout er aan toevoegd, ga je uitzouten,
280nm, peptidebindingen absorberen een beetje, tryptofaan en tyrosine absorberen heel
goed bij 280nm. Als je eiwit dat veel heeft, kun je goed meten hoeveel eiwit je in je oplossing
hebt. Als je ammoniumsulfaat toevoegd, ga je van 1000 naar 600 totaal eiwit. Een groot deel
ben je dan al kwijt. Je enzymactiviteit neemt niet af, die blijft gelijk en zit dus netjes nog in
oplossing. Na toevoeging van meer zout, ben je het meeste eiwit kwijt, klein beetje van
enzymactiviteit gaat verloren.
Je kunt ook uitzuren. Kan op 2 manieren:
- Je trekt hydratiemantel weg (uitzouten (eiwitten
lossen minder goed op bij te hoge zoutconcentratie)
- Je veranderdt de pH, omeving veranderd en
ladingstoestand dus ook
- Als je de pH zuur genoeg maakt, alle zuurgroepen
protoneren, basen ook. Alle negatieve ladingen vallen
weg, alles positieve ladingen blijven positief, geen
interacties meer en structuur wordt verbroken.
Waardoor eiwit meer klontert.
- TCA slaat wel neer maar raakt niet gedenatureert.
Boven isoelektrisch punt: eiwit oppervlak negatief geladen.
Totale lading eiwit : negatief Isoelektrisch punt : 0. Onder pH
van elektrisch punt: positief geladen oppervlak.
Lage pH: kun je eiwit er totaal uithalen, geen functioneel eiwit meer iso elektrisch
precipitatie.
Coprecipitatie = neerslag van stoffen die normaal oplosbaar zijn.
Sommige eiwitten zitten aan celmembranen, of zitten erdoorheen. Transmembraan eiwitten
2 hydrofobe benen, en hydrofiele kop. De benen zitten bij elkaar en de kopjes gaan bij
water zitten. Aan de onderkant zit een vlak waar de beentjes bij elkaar zitten van de lagen.
Daaronder zit weer water waar die kopjes weer aangaan. Binnenkant is dus apolair. Eiwit is
