KLINISCHE BIOLOGIE
ANALYTISCHE TECHNIEKEN
FOTOMETRIE
Fotometrie: meten van licht
• Lichtintensiteit meten voor en na passeren
• Transmissie: percentage van invallend licht dat wordt doorgelaten
o Transmissie = 100%
§ Geen licht geabsorbeerd
• Intensiteit uitgaande licht = intensitiet invallend licht
o Transmissie = 75%
§ Stof absorbeert 25% van licht
• Extinctie (E): het uitdoven van licht
o = absorptie
o E = 2 – log %T
§ Indien transmissie 100% → E = 0
§ Indien transmissie 75% → E = 0,125
• De wet van Lambert-Beer: E = ε × c × l
o Waarbij
§ E = extincitie
§ ε = molaire extinctiecoëfficiënt
• hoe goed een bepaalde stof licht absorbeert bij specifieke golflengte
§ c = conc kleurstof
§ l = lengte van cuvet
• meestal 1 cm
o extinctie is lineair gerelateerd aan conc kleurstof in oplossing
o ε en l als constante waarden beschouw
§ ε zelfde specifiek van elke stof met specifieke golflengte
§ l meestal standaard 1 cm
o lineir verband extinctie en conc geldt alleen voor licht met specifieke golflengte
§ gebruik fotometrische meting monochomatisch licht
• = licht van 1 bepaalde golflengte
,PRAKTISCH VOORBEELD
• Probleem: bij fotometrie geïntresseerd in heldere, gekleurde oplossingen, maar meeste stoffen in
lichaam zijn kleurloos → hoe stoffen meten in labo?
o Stoffen door chemische rea omgezet in gekleurde verbinding
§ Zo mogelijkheid fotometrie
Stel: totame eiwitconcentratie in serumstaal bepalen
• Biuret-reagens toevoegen aan stal
o Reageert met aanwezige eiwitten
§ Paarse kleur → eiwitten aanwezig
• Kleur meetbaar bij golflengte 540 nm
§ Kleurloos → geen eiwitten aanwezig
• Gebruik verschillende stalen
o Blancostaal
o Standaardstalen
§ Bekende eiwitconcentraties → ijklijn opstellen
o Serumstaal patiënt
• Cuvet met water opvullen → extinctie meten
o =0
o Dient als referentie
• Analyse van blancostaal
o Verschillend van water → door bevatten Biuret-reagens
§ Biuret absorbeertklein beetje licht → achtegrondruis
o Later achtergrond ruis van alle andere metingen aftrekken
§ Om ruis van Biuret te corrigeren
• Extinctie van standaarden meten
o Achtergonrdruis van aftrekken
o Ijklijn/calibratiecuve opstellen
• Adhv extinctie patiënt de bijhorende eiwitconcentratie op curve aflezen
• Stalen niet handmatig gevuld → grote geautomatiseerde apparatuur
o Gemiddelde doorlooptijd = 40 min
o Gebruikt voor veel routine laboparameters
§ Amylase
§ ALT ,AST
§ Alkalisch fosfatase, albumine
,HEMOCYTOMETRIE
MANUELE MICROSCOPIE
• Hemocytometrie: techniek voor tellen aantal bloedcellen
o Vroeger: telkamers en microscopen
§ Differentiatie WBC gemaakt
AUTOMATISCHE CELTELLER
• Automatische celtellers → minder arbeidsintensief proces
o Gebruik van fysische eigenschappen van cellen
§ Lichtverstooiing
§ Elektrische impedantie
§ Fluoresecentie
• Hydrodynamische focusering: staal met cellen zodanig gefocust dat cellen 1 voor 1 door laserstraal
gaaan
o 2 soorten verstrooiing bij laser op cel
§ Voorwaartse verstrooiing: info over grootte van de cel
• Hoe meer voorwaartse verstrooiing, hoe groter de cel
§ Zijwaartse verstrooiing: geef inzicht in granulariteit van de cel
• Hoe meer cel granules bevat, hoe groter zijwaartse verstrooiing
o Cellen met meeste granules:
§ Neutrofielen
§ Eosinofielen
§ Basofielen
• Fluorescerende stoffen toegevoegd
o Binden DNA en RNA van cellen
o Verschillen in fluoresecentie → verschillende types WBC onderscheiden
• SFL - SSC op Scatterplot
o Info over
§ SFL: DNA en RNA door fluoresecrende stiffen
§ SSC: granulariteit van cellen
o Overlap neutrofielen en baspofielen
§ Geen onderscheid mogelijk
o Elk punt vertegenwoordigt ene cel die laser passeert
, TYPE BLOEDCELLEN
% Functie
45-70 • Verantwoordelijk voor eerste afweer tegen
bacteriële infecties
NEUTROFIELEN o Fagocyterende rol
• Rol andere onstekingsreacties
o Bron pyusvorming
20-46 • T-lymfocyten
o T-helpercellen
o Cytotoxische T-cellen
• B-lymfocyten
LYMFOCYTEN
• NK-cellen
• Plasmacellen
o = geactiveerde B-lymfocyten
→ rol bij specifieke immuunrespons
2-12 • Eliminatie van antigenen door fagocytose
MONOCYT
• Aanbieden van antigenen aan lymfocyten
1-6 • Beperkte fagocyterende activiteit
EOSINOFIEL • Rol in ontstaan allergische reactes
• Rol in bestrijden parasitaire infecties
0-2 • Rol bij op gang komen inflammatoire respons
BASOFIEL • Verantwoordelijk voor allergische reacties
o Samen met mastocyten
DIFFERENTIËLE LEUKOCYTENTELLING
= MOMENTOPNAME van dynamiek van versch perifeer cirulerende WBC
• Aantal circulerende cellen bepaald door
o Instroom vanuit beenmerg
o Transitietijd in perifeer bloed
o Uitstroom naar weefsels
• In bloed niet alleen circulerende pool, maar ook marginale pool
o Marginale pool = recirculatie waarbij cellen uit weefsels terig in bloedbaan komen
§ Bestaande uit meer dan de helft WBC die aan bloedvat kleven
• Bij stress → stijging ADR → cellen uit marginale pool los
• Dan in circulatie → gemeten tijdens normale telling → WBC in paar minuten
verdubbelt
ANALYTISCHE TECHNIEKEN
FOTOMETRIE
Fotometrie: meten van licht
• Lichtintensiteit meten voor en na passeren
• Transmissie: percentage van invallend licht dat wordt doorgelaten
o Transmissie = 100%
§ Geen licht geabsorbeerd
• Intensiteit uitgaande licht = intensitiet invallend licht
o Transmissie = 75%
§ Stof absorbeert 25% van licht
• Extinctie (E): het uitdoven van licht
o = absorptie
o E = 2 – log %T
§ Indien transmissie 100% → E = 0
§ Indien transmissie 75% → E = 0,125
• De wet van Lambert-Beer: E = ε × c × l
o Waarbij
§ E = extincitie
§ ε = molaire extinctiecoëfficiënt
• hoe goed een bepaalde stof licht absorbeert bij specifieke golflengte
§ c = conc kleurstof
§ l = lengte van cuvet
• meestal 1 cm
o extinctie is lineair gerelateerd aan conc kleurstof in oplossing
o ε en l als constante waarden beschouw
§ ε zelfde specifiek van elke stof met specifieke golflengte
§ l meestal standaard 1 cm
o lineir verband extinctie en conc geldt alleen voor licht met specifieke golflengte
§ gebruik fotometrische meting monochomatisch licht
• = licht van 1 bepaalde golflengte
,PRAKTISCH VOORBEELD
• Probleem: bij fotometrie geïntresseerd in heldere, gekleurde oplossingen, maar meeste stoffen in
lichaam zijn kleurloos → hoe stoffen meten in labo?
o Stoffen door chemische rea omgezet in gekleurde verbinding
§ Zo mogelijkheid fotometrie
Stel: totame eiwitconcentratie in serumstaal bepalen
• Biuret-reagens toevoegen aan stal
o Reageert met aanwezige eiwitten
§ Paarse kleur → eiwitten aanwezig
• Kleur meetbaar bij golflengte 540 nm
§ Kleurloos → geen eiwitten aanwezig
• Gebruik verschillende stalen
o Blancostaal
o Standaardstalen
§ Bekende eiwitconcentraties → ijklijn opstellen
o Serumstaal patiënt
• Cuvet met water opvullen → extinctie meten
o =0
o Dient als referentie
• Analyse van blancostaal
o Verschillend van water → door bevatten Biuret-reagens
§ Biuret absorbeertklein beetje licht → achtegrondruis
o Later achtergrond ruis van alle andere metingen aftrekken
§ Om ruis van Biuret te corrigeren
• Extinctie van standaarden meten
o Achtergonrdruis van aftrekken
o Ijklijn/calibratiecuve opstellen
• Adhv extinctie patiënt de bijhorende eiwitconcentratie op curve aflezen
• Stalen niet handmatig gevuld → grote geautomatiseerde apparatuur
o Gemiddelde doorlooptijd = 40 min
o Gebruikt voor veel routine laboparameters
§ Amylase
§ ALT ,AST
§ Alkalisch fosfatase, albumine
,HEMOCYTOMETRIE
MANUELE MICROSCOPIE
• Hemocytometrie: techniek voor tellen aantal bloedcellen
o Vroeger: telkamers en microscopen
§ Differentiatie WBC gemaakt
AUTOMATISCHE CELTELLER
• Automatische celtellers → minder arbeidsintensief proces
o Gebruik van fysische eigenschappen van cellen
§ Lichtverstooiing
§ Elektrische impedantie
§ Fluoresecentie
• Hydrodynamische focusering: staal met cellen zodanig gefocust dat cellen 1 voor 1 door laserstraal
gaaan
o 2 soorten verstrooiing bij laser op cel
§ Voorwaartse verstrooiing: info over grootte van de cel
• Hoe meer voorwaartse verstrooiing, hoe groter de cel
§ Zijwaartse verstrooiing: geef inzicht in granulariteit van de cel
• Hoe meer cel granules bevat, hoe groter zijwaartse verstrooiing
o Cellen met meeste granules:
§ Neutrofielen
§ Eosinofielen
§ Basofielen
• Fluorescerende stoffen toegevoegd
o Binden DNA en RNA van cellen
o Verschillen in fluoresecentie → verschillende types WBC onderscheiden
• SFL - SSC op Scatterplot
o Info over
§ SFL: DNA en RNA door fluoresecrende stiffen
§ SSC: granulariteit van cellen
o Overlap neutrofielen en baspofielen
§ Geen onderscheid mogelijk
o Elk punt vertegenwoordigt ene cel die laser passeert
, TYPE BLOEDCELLEN
% Functie
45-70 • Verantwoordelijk voor eerste afweer tegen
bacteriële infecties
NEUTROFIELEN o Fagocyterende rol
• Rol andere onstekingsreacties
o Bron pyusvorming
20-46 • T-lymfocyten
o T-helpercellen
o Cytotoxische T-cellen
• B-lymfocyten
LYMFOCYTEN
• NK-cellen
• Plasmacellen
o = geactiveerde B-lymfocyten
→ rol bij specifieke immuunrespons
2-12 • Eliminatie van antigenen door fagocytose
MONOCYT
• Aanbieden van antigenen aan lymfocyten
1-6 • Beperkte fagocyterende activiteit
EOSINOFIEL • Rol in ontstaan allergische reactes
• Rol in bestrijden parasitaire infecties
0-2 • Rol bij op gang komen inflammatoire respons
BASOFIEL • Verantwoordelijk voor allergische reacties
o Samen met mastocyten
DIFFERENTIËLE LEUKOCYTENTELLING
= MOMENTOPNAME van dynamiek van versch perifeer cirulerende WBC
• Aantal circulerende cellen bepaald door
o Instroom vanuit beenmerg
o Transitietijd in perifeer bloed
o Uitstroom naar weefsels
• In bloed niet alleen circulerende pool, maar ook marginale pool
o Marginale pool = recirculatie waarbij cellen uit weefsels terig in bloedbaan komen
§ Bestaande uit meer dan de helft WBC die aan bloedvat kleven
• Bij stress → stijging ADR → cellen uit marginale pool los
• Dan in circulatie → gemeten tijdens normale telling → WBC in paar minuten
verdubbelt
