Samenvatting Cel II Cytologie Microscopie

Samenvatting cytologie
cel II (LM)
1. Lichtmicroscopie
1.1 Overzicht
 Resolutie: 200 nm (= kleinste afstand waarmee 2 punten nog
net gescheiden worden weergegeven) bepaald door:
o Objectief
o Golflengte van zichtbaar licht
 Effectieve resolutie mede bepaald door natuur preparaat:
o Gefixeerd en gekleurd (hematoxyline/eosine)
o Levend met doorgaans te weinig contrast
 Vergroting: product van oculair (10x) en objectieflens (4,10, 40,
100x) -> max. 1000x vergroten

1.2 Opstelling (Klaar-veld)
Meeste preparaten worden in LM bekeken met doorvallend wit licht

Bestaat uit 3 lenssystemen:
 Condensor: bundelt het doorvallend licht op preparaat
Bepalen: lichtsterkte,
 Objectief: kijkt met zeer korte werkafstanden naar preparaat (vergroot beeld)
resolutie, kwaliteit
 Oculair: beeld navergroten en op retina projecteren
+
 Verstelbare tafel
 Prisma: lichtweg buigen voor comf zitpositie

Verschillende soorten:
1. Klaar-veld microscoop
2. Fase-contrast microscoop
3. Fluorescentie microscoop

1.3 Speciale lichtmicroscopen voor levende cellen
 Fasecontrastmicroscopie
o Basis van faseverschuiving van licht
o Kleine faseveranderingen, ontstaan door brekingsverschillen in preparaat ->
amplitudeveranderingen (licht/donker)
o Toegepast op ongekleurde preparaten (gekweekte levende cellen of vriescoupes)
 Differentieel interferentie-contrastmicroscopie (DIC / Nomarski)
o Basis van +/- interferentie van gepolariseerd licht
o 3D beeld levende cellen
 Digitale microscopie
o Computerverwerking van beelden met ultragevoelige videocamera’s
o Dynamisch
 Donkerveldmicroscopie
o Kleine objecten (bacteriën, organellen)
 (fluorescentie)microscopen
o Zie verder
o Life cell imaging

, 1.4 principes lichtmicroscopie
 Contrast verhogen
o Met kleuring:
Histologische kleuring: reduceert amplitude van bep. λ -> kleuring
o Zonder kleuring:
Verschillen in optische dichtheid -> beeldcontrast
 Afwijkende brekingsindex -> faseverschuiving
 Interferentie (+/-): zwart-wit beeld

1.5 voorbeeld lichtmicroscopische analyse
Kleuring darmvillus met

 PAS (Periodic Acid Shiff) -> vrije suikers
 Hematoxyline -> nucleïnezuren
 Eosine -> NH2 groepen van EW

1.6 Fluorescentiemicroscopie
 Epi-illuminaite = meest gebruikte illuminatiesysteem
 Objectieflens + condensor + objectief in 1
 Epifluorescentie
 Activeert met excitatielicht van korte λ (ultraviolet-blauw, groen)
 Fluorchrome stof in preparaat zendt emissielicht uit van langere λ (resp. groen, rood-
infrarood)
 Conventioneel (met kwikdamplamp als lichtbron)
 Confocale laser scanning microscopie (CLSM) (met laser als lichtbron)

1.6.1 Principes:
1. Excitatiebron: Hg of Xe lamp
2. λ – filters in een filterkubus:
 Excitatiefilter
 Dichroïsche spiegel (beamsplitter)
 Emissiefilter of stopfilter
3. Detector: ogen of camera

fluorocroom: bv. alexa 488 (liefst aanslaan met λ 488 nm, mr je kan niet 1 λ doorlaten (je laat
bv enkel 450 tot 550 nm door), vervolgens 2 e filter: laat enkel licht toe van > 515nm  alexa 488
w zichtbaar


1.6.2 Gebruik:
 Aankleuren en kwantificeren
o Ion-gevoelige kleurstoffen: fluorchroom reageert met ion, kleur op basis van
concentratie ion (bv fura-2 met Ca2+ )
o Immunofluorescentie: EW detecteren mbv Ig’s gebonden aan fluorchroom
o Tagging van EW met fluorescente EW (spec EW in levende cellen detecteren)