Metabolisme hoofdstuk 10
Enzymatische activiteit wordt op 5 manieren gereguleerd:
- Allosterische controle: de binding van kleine moleculen aan de regulatory sites controleert de
activiteit van de eiwitten. Daarnaast kennen deze eiwitten cooperativiteit; activiteit aan een
functionele site heeft invloed op de activiteit van de andere sites. Allosterische enzymen zijn
vaak informatie transducers, de activiteit van de eiwitten verandert aan de hand van signaal
moleculen.
o Een voorbeeld van een allosterisch eiwit is aspartate transcarbamoylase (ATCase).
De eerste stap van de katalyse van pyrimidine biosynthese wordt geïnhibeert door
cytidine trifosfaat, dit is dus een voorbeeld van feedback inhibition.
o Een ander voorbeeld is hemoglobine.
- Multiple forms of enzymes: isozymen zijn homologe enzymen binnen een organisme die
dezelfde reactie katalyseren maar een beetje verschillen in structuur (en dus Km en Vmax) en
regulerende eigenschappen.
- Reversible covalent modification: de katalytische eigenschappen van veel enzymen wordt
sterk verandert door de covalente binding van een groep (meestal fosforyl groep). Meestal
dient ATP als de fosforyl donor en wordt de reactie gekatalyseerd door protein kinases. De
groepen worden verwijderd door hydrolyse middels een eiwit fosfatase.
- Proteolytische activatie: dit regulerende mechanisme is onomdraaibaar en zet een inactief
enzym permanent om in een actief enzym. Enzymen worden geactiveerd door de hydrolyse
van enkele peptiden vanuit de voorloper, ook wel de zymogens of proenzymen.
o Voorbeelden hiervan zijn chymotrypsine, trypsine en pepsine.
- Controleren van de hoeveelheid enzym die aanwezig is.
Allosterisch gecontroleerde enzymen (ATCase)
De reactie gekatalyseerd door apartate transcarbamoylase verloopt in 10 stappen en resulteert in
UTP en CTP. ATCcase wordt geïnhibeert door CTP, hierdoor is de snelheid van de reactie van ATCase
snel bij een lage concentratie CTP en neemt deze af als de concentratie CTP toeneemt. Dus er
worden CTP’s gevormd tot er voldoende CTP’s geaccumuleerd zijn. De feedback inhibitie voorkomt
dat de beginstoffen of tussenproducten niet zonder reden gevormd worden als er al voldoende
pyrimidines zijn.
De inhibitie door CTP is uitzonderlijk omdat dit molecuul structureel zeer anders is dan de substraten
van de reactie (carbamoyl fosfaat en aspartate). Dit betekent dus dat CTP moet binden op een
allosterische site. In ATCase liggen de katalytische en de regulerende sites op een andere
peptideketen.
De curve van dit enzym is een sigmoidal (‘S’) curve. De meeste allosterische enzymen vertonen
sigmoïdal kinetics. Als het enzym behandeld wordt met stoffen die reageren met sulfhydryl groepen
kan ATCase letterlijk worden verdeeld in regulerende (r) en katalyserende (c) subeenheden. De twee
subeenheden waar ATCase uit is opgebouwd kunnen gescheiden worden met ion-exchange
chromatografie (ze verschillen in lading) of centrifugatie in een sucrose dichtheids gradiënt (ze
verschillen in grootte). De grotere subeenheid is de c subeenheid, dit subeenheid vertoont de
hyperbolische kinetics van Michaelis-Menten enzymen. Daarnaast is het katalyserende subeenheid
ook ongevoelig voor CTP. Het regulerende subeenheid heeft geen katalyserende activiteit. De c
subeenheid bestaat uit drie ketens, de r subeenheid uit twee. De twee subeenheden recombineren
, als ze gemixt worden volgens c6r6. De interactie van deze subeenheden resulteert in het native enzym
met zowel katalytische als regulerende activiteit.
2 katalytische trimeren stapelen op elkaar en worden gekoppeld door 3 regulerende dimeren. Elke r
keten van het dimeer staat in contact met een c keten van het trimeer. De c subeenheid maakt
contact met het structurele domein van het r domein bestaande uit een zink ion en vier cysteïne
residuen. Componenten met kwik kunnen deze interactie verbreken omdat kwik sterker bindt aan
cysteïne dan zink.
Om de active site van het enzym te bepalen wordt het gekristalliseerd met PALA (een substraat
analoog) wat sterk lijkt op een tussenproduct van de pathway. Het ATCase-PALA-complex toont dat
PALA bindt op plekken op de grens van paren c ketens. Elke c keten draagt dus bij aan drie active
sites van het complete enzym.
Als PALA bindt bewegen de twee dimeren 12A uit elkaar en roteren 10 graden. Daarnaast moeten de
dimeren 15 graden mee draaien. De twee vormen van het enzym worden de T (tense) staat en de R
(relaxed) staat genoemd. Het enzym bestaat in een evenwicht tussen deze twee staten. In de
afwezigheid van het substraat bevinden bijna alle enzymen zich in de R staat omdat deze meer
stabiel is. De ratio tussen de T en de R staat wordt de allosterische constante (L) genoemd.
L = T/R (meestal in een orde van 102 tot 103)
De T staat heeft een lage affiniteit voor het substraat en vertoont dus een lage katalytische activiteit.
Als er een substraat gebonden wordt verhoogd dit de kans dat het enzym overgaat op de R staat. Het
verhogen van de concentratie substraat verhoogt de factie van enzymen in de R staat omdat de
positie van het evenwicht afhankelijk is van het aantal active sites die bezet zijn door substraat. Het
effect van substraat op allosterische enzymen wordt homotropic genoemd omdat de affiniteit van
alle subeenheden wordt verhoogd.
- Concerted model: het veranderen van het enzym is ‘all or none’; het gehele enzym gaat
overnaar R wat alle active sites op gelijke manier beïnvloedt.
- Sequential model: het binden van het ligand aan een van de subeenheden kan effect hebben
op aangelegen subeenheden zonder dat alle subenheden de T naar R transitie ondergaan.
Het concerted model verklaart het gedrag van ATCase goed, terwijl de meeste enzymen een mix van
beide mechanismen hebben.
De sigmoïdische curve van ATCase kan gezien worden als twee M-M curves; een voor de T en een
voor de R staat. Bij lage concentraties substraat lijkt de curve het meeste op de T staat curve. Als de
substraat concentratie toeneemt lijkt de curve steeds meer op de R curve.
Allosterische enzymen kunnen overgaan van een actieve naar een minder actieve staat binnen een
smalle reeks van substraat concentraties. De activiteit van allosterische enzymen is gevoeliger voor
een verandering in substraat concentratie (bij de Km) dan andere M-M enzymen met dezelfde Vmax.
Deze gevoeligheid wordt het treshold effect genoemd. Dus onder een bepaalde concentratie is er
weinig enzym activiteit, boven deze concentratie is er heel veel activiteit. Cooperativiteit verzekert
dat een groot deel van de enzymen in de T of de R staat zit.
X-ray studies van ATCase in de aanwezigheid van CTP toonde dat het enzym in de T staat zit als CTP
gebonden is en dat de bindingsplek voor CTP in elke r keten zit in het domein wat geen interactie
aangaat met een c subeenheid. Dit betekent dat elke active site 50A weg zit van een CTP-bindingsite.
De binding van CTP maakt het moeilijker voor de binding van substraat om het enzym in de R staat te
brengen. Hierdoor verhoogt CTP de initiële fase van de sigmoïdische curve (de curve verschuift naar
rechts). Er is dus meer substraat nodig om een bepaalde reactiesnelheid te bereiken. UTP verlaagt
ook de ATCase activiteit. ATP is ook een allosterische effector van ATCase en bindt op dezelfde plek
als CTP. Alleen stabiliseert ATP juist de R staat, hierdoor wordt een hogere reactiesnelheid bij een
Enzymatische activiteit wordt op 5 manieren gereguleerd:
- Allosterische controle: de binding van kleine moleculen aan de regulatory sites controleert de
activiteit van de eiwitten. Daarnaast kennen deze eiwitten cooperativiteit; activiteit aan een
functionele site heeft invloed op de activiteit van de andere sites. Allosterische enzymen zijn
vaak informatie transducers, de activiteit van de eiwitten verandert aan de hand van signaal
moleculen.
o Een voorbeeld van een allosterisch eiwit is aspartate transcarbamoylase (ATCase).
De eerste stap van de katalyse van pyrimidine biosynthese wordt geïnhibeert door
cytidine trifosfaat, dit is dus een voorbeeld van feedback inhibition.
o Een ander voorbeeld is hemoglobine.
- Multiple forms of enzymes: isozymen zijn homologe enzymen binnen een organisme die
dezelfde reactie katalyseren maar een beetje verschillen in structuur (en dus Km en Vmax) en
regulerende eigenschappen.
- Reversible covalent modification: de katalytische eigenschappen van veel enzymen wordt
sterk verandert door de covalente binding van een groep (meestal fosforyl groep). Meestal
dient ATP als de fosforyl donor en wordt de reactie gekatalyseerd door protein kinases. De
groepen worden verwijderd door hydrolyse middels een eiwit fosfatase.
- Proteolytische activatie: dit regulerende mechanisme is onomdraaibaar en zet een inactief
enzym permanent om in een actief enzym. Enzymen worden geactiveerd door de hydrolyse
van enkele peptiden vanuit de voorloper, ook wel de zymogens of proenzymen.
o Voorbeelden hiervan zijn chymotrypsine, trypsine en pepsine.
- Controleren van de hoeveelheid enzym die aanwezig is.
Allosterisch gecontroleerde enzymen (ATCase)
De reactie gekatalyseerd door apartate transcarbamoylase verloopt in 10 stappen en resulteert in
UTP en CTP. ATCcase wordt geïnhibeert door CTP, hierdoor is de snelheid van de reactie van ATCase
snel bij een lage concentratie CTP en neemt deze af als de concentratie CTP toeneemt. Dus er
worden CTP’s gevormd tot er voldoende CTP’s geaccumuleerd zijn. De feedback inhibitie voorkomt
dat de beginstoffen of tussenproducten niet zonder reden gevormd worden als er al voldoende
pyrimidines zijn.
De inhibitie door CTP is uitzonderlijk omdat dit molecuul structureel zeer anders is dan de substraten
van de reactie (carbamoyl fosfaat en aspartate). Dit betekent dus dat CTP moet binden op een
allosterische site. In ATCase liggen de katalytische en de regulerende sites op een andere
peptideketen.
De curve van dit enzym is een sigmoidal (‘S’) curve. De meeste allosterische enzymen vertonen
sigmoïdal kinetics. Als het enzym behandeld wordt met stoffen die reageren met sulfhydryl groepen
kan ATCase letterlijk worden verdeeld in regulerende (r) en katalyserende (c) subeenheden. De twee
subeenheden waar ATCase uit is opgebouwd kunnen gescheiden worden met ion-exchange
chromatografie (ze verschillen in lading) of centrifugatie in een sucrose dichtheids gradiënt (ze
verschillen in grootte). De grotere subeenheid is de c subeenheid, dit subeenheid vertoont de
hyperbolische kinetics van Michaelis-Menten enzymen. Daarnaast is het katalyserende subeenheid
ook ongevoelig voor CTP. Het regulerende subeenheid heeft geen katalyserende activiteit. De c
subeenheid bestaat uit drie ketens, de r subeenheid uit twee. De twee subeenheden recombineren
, als ze gemixt worden volgens c6r6. De interactie van deze subeenheden resulteert in het native enzym
met zowel katalytische als regulerende activiteit.
2 katalytische trimeren stapelen op elkaar en worden gekoppeld door 3 regulerende dimeren. Elke r
keten van het dimeer staat in contact met een c keten van het trimeer. De c subeenheid maakt
contact met het structurele domein van het r domein bestaande uit een zink ion en vier cysteïne
residuen. Componenten met kwik kunnen deze interactie verbreken omdat kwik sterker bindt aan
cysteïne dan zink.
Om de active site van het enzym te bepalen wordt het gekristalliseerd met PALA (een substraat
analoog) wat sterk lijkt op een tussenproduct van de pathway. Het ATCase-PALA-complex toont dat
PALA bindt op plekken op de grens van paren c ketens. Elke c keten draagt dus bij aan drie active
sites van het complete enzym.
Als PALA bindt bewegen de twee dimeren 12A uit elkaar en roteren 10 graden. Daarnaast moeten de
dimeren 15 graden mee draaien. De twee vormen van het enzym worden de T (tense) staat en de R
(relaxed) staat genoemd. Het enzym bestaat in een evenwicht tussen deze twee staten. In de
afwezigheid van het substraat bevinden bijna alle enzymen zich in de R staat omdat deze meer
stabiel is. De ratio tussen de T en de R staat wordt de allosterische constante (L) genoemd.
L = T/R (meestal in een orde van 102 tot 103)
De T staat heeft een lage affiniteit voor het substraat en vertoont dus een lage katalytische activiteit.
Als er een substraat gebonden wordt verhoogd dit de kans dat het enzym overgaat op de R staat. Het
verhogen van de concentratie substraat verhoogt de factie van enzymen in de R staat omdat de
positie van het evenwicht afhankelijk is van het aantal active sites die bezet zijn door substraat. Het
effect van substraat op allosterische enzymen wordt homotropic genoemd omdat de affiniteit van
alle subeenheden wordt verhoogd.
- Concerted model: het veranderen van het enzym is ‘all or none’; het gehele enzym gaat
overnaar R wat alle active sites op gelijke manier beïnvloedt.
- Sequential model: het binden van het ligand aan een van de subeenheden kan effect hebben
op aangelegen subeenheden zonder dat alle subenheden de T naar R transitie ondergaan.
Het concerted model verklaart het gedrag van ATCase goed, terwijl de meeste enzymen een mix van
beide mechanismen hebben.
De sigmoïdische curve van ATCase kan gezien worden als twee M-M curves; een voor de T en een
voor de R staat. Bij lage concentraties substraat lijkt de curve het meeste op de T staat curve. Als de
substraat concentratie toeneemt lijkt de curve steeds meer op de R curve.
Allosterische enzymen kunnen overgaan van een actieve naar een minder actieve staat binnen een
smalle reeks van substraat concentraties. De activiteit van allosterische enzymen is gevoeliger voor
een verandering in substraat concentratie (bij de Km) dan andere M-M enzymen met dezelfde Vmax.
Deze gevoeligheid wordt het treshold effect genoemd. Dus onder een bepaalde concentratie is er
weinig enzym activiteit, boven deze concentratie is er heel veel activiteit. Cooperativiteit verzekert
dat een groot deel van de enzymen in de T of de R staat zit.
X-ray studies van ATCase in de aanwezigheid van CTP toonde dat het enzym in de T staat zit als CTP
gebonden is en dat de bindingsplek voor CTP in elke r keten zit in het domein wat geen interactie
aangaat met een c subeenheid. Dit betekent dat elke active site 50A weg zit van een CTP-bindingsite.
De binding van CTP maakt het moeilijker voor de binding van substraat om het enzym in de R staat te
brengen. Hierdoor verhoogt CTP de initiële fase van de sigmoïdische curve (de curve verschuift naar
rechts). Er is dus meer substraat nodig om een bepaalde reactiesnelheid te bereiken. UTP verlaagt
ook de ATCase activiteit. ATP is ook een allosterische effector van ATCase en bindt op dezelfde plek
als CTP. Alleen stabiliseert ATP juist de R staat, hierdoor wordt een hogere reactiesnelheid bij een
