Mobi biomedische basistechnieken
Inhoud
Inleiding : opdracht 1............................................................................................................................... 4
Interleukine 1 ...................................................................................................................................... 4
Humaan EVL ........................................................................................................................................ 5
Onderzoekslijn 1 ...................................................................................................................................... 6
Doel ..................................................................................................................................................... 6
Opdracht 2 : DEEL A : Vergelijkende analyse van gebruikte plasmiden .............................................. 6
BASISTERMINOLOGIE ...................................................................................................................... 6
ANALYSE VAN DE SEQUENTIE VAN VECTOR pET30a ........................................................................ 7
ANALYSE SELECTABLE MARKER........................................................................................................ 7
ANALYSE EXPRESSIEPLASMIDE pET30-hIL-1B .................................................................................. 7
EXTRA UITLEG .................................................................................................................................. 7
SOP 1 : LB-agar platen gieten .............................................................................................................. 8
INLEIDING ........................................................................................................................................ 8
BENODIGDHEDEN ............................................................................................................................ 8
PROTOCOL ....................................................................................................................................... 8
SOP 2 : transformatie van bacteriën.................................................................................................... 9
INLEIDING ........................................................................................................................................ 9
BENODIGDHEDEN ............................................................................................................................ 9
PROTOCOL ....................................................................................................................................... 9
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 10
Opdracht 2 : DEEL B : in silico voorbereiden van colony PCR ............................................................ 10
PRIMERS ANALYSE ......................................................................................................................... 10
SOP 3 : Colony PCR ............................................................................................................................ 10
INLEIDING ...................................................................................................................................... 10
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 10
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 11
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 11
Opdracht 2 : DEEL C : in silico restrictiedigest van de plasmiden ...................................................... 11
RESTRICTIEDIGEST ......................................................................................................................... 11
DIGEST IN SILICO............................................................................................................................ 12
SOP 4 : Miniprep : plasmide DNA-bereiding ..................................................................................... 12
INLEIDING ...................................................................................................................................... 12
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 13
1
, PROTOCOL ..................................................................................................................................... 13
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 14
SOP 5 : Restrictiedigest ...................................................................................................................... 14
INLEIDING ...................................................................................................................................... 14
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 14
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 14
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 15
SOP 6 : Agarosegelelektroforese ....................................................................................................... 15
INLEIDING ...................................................................................................................................... 15
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 16
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 16
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 16
Resultaten onderzoekslijn 1 .............................................................................................................. 16
Onderzoekslijn 2 .................................................................................................................................... 17
Doel ................................................................................................................................................... 17
Opdracht 3 : DEEL A : inductie van recombinante eiwitproductie .................................................... 17
EIGENSCHAPPEN VAN RECOMBINANTE EIWITPRODUCTIE ........................................................... 17
EXTRA REGULERENDE ELEMENTEN ............................................................................................... 18
AANSWITCHEN VAN RECOMBINANTE EIWITPRODUCTIE .............................................................. 18
ANALYSE VAN RECOMBINANTE EXPRESSIE.................................................................................... 19
RECOMBINANTE EXPRESSIE VAN HUMAAN EVL ........................................................................... 20
SOP 7 : SDS-page ............................................................................................................................... 20
INLEIDING ...................................................................................................................................... 20
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 21
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 22
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 22
Resultaten onderzoekslijn 2 .............................................................................................................. 22
Opdracht 4 : Kloneren via benchling voor in silico ............................................................................ 22
STAP 1 : VOORBEREIDING .............................................................................................................. 22
STAP 2 : IN SILICO KNIPPEN EN PLAKKEN ...................................................................................... 23
Onderzoekslijn 3 .................................................................................................................................... 26
Doel ................................................................................................................................................... 26
Opdracht 3 : DEEL B : recombinante eiwitproductie ......................................................................... 26
TAGGEN VAN hIL-1B EN EVL EIWIT ................................................................................................ 26
ROL VAN TAGGING BIJ EIWITZUIVERING VIA AFFINITY PURIFICATION ......................................... 26
SOP 8 : concentratiebepaling : Bradford assay .................................................................................. 27
2
, INLEIDING ...................................................................................................................................... 27
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 28
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 28
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 28
SOP 10 : ELISA variant voor humaan EVL .......................................................................................... 29
INLEIDING ...................................................................................................................................... 29
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 31
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 31
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 32
Resultaten onderzoekslijn 3 .............................................................................................................. 32
Onderzoekslijn 4 .................................................................................................................................... 33
Doel : ................................................................................................................................................. 33
Opdracht 6 : ....................................................................................................................................... 33
SOP 9 : ............................................................................................................................................... 35
INLEIDING ...................................................................................................................................... 35
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 36
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 36
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 37
Resultaten onderzoekslijn 4 .............................................................................................................. 37
Opdracht 5 : ....................................................................................................................................... 37
3D-STRCUTUUR VAN EVL EIWIT .................................................................................................... 37
3D STRUCTUUR VAN HUMAAN IL-1B ............................................................................................ 37
3D STRUCTUUR VAN COMPLEX HUMAAN IL-1B EN MEMBRAANRECEPTOR ................................ 38
AMINOZUREN IN RECEPTOR EN LIGAND ....................................................................................... 38
3
,Inleiding : opdracht 1
Interleukine 1
Interleukine 1 (IL-1) is een pro-inflammatoire cytokine die essentieel is voor de communicatie binnen
het immuunsysteem. Het wordt geproduceerd door immuuncellen en speelt een belangrijke rol bij
het reguleren van de aangeboren immuniteit. IL-1 bevordert onder andere T-cel activatie,
collageenproductie en fibroblastproliferatie, en veroorzaakt een stijging van de lichaamstemperatuur.
Het gen interleukine 1 beta (IL1B) codeert voor een inactief precursor-eiwit genaamd pro-IL-1β. Dit
eiwit wordt wanneer het protease caspase-1 inwerkt heomzet in het actieve IL-1β-eiwit, dat
vervolgens door cellen wordt uitgescheiden. Het actieve IL-1β-eiwit bestaat uit één domein en verlaat
de cel niet via de normale secretorische route vanwege het ontbreken van een signaalpeptide.
IL-1β bindt aan transmembraanreceptoren die heterodimeren vormen, namelijk de primaire
membraanreceptor IL-1R1 (Interleukine 1 receptor type I) en de coreceptor IL-1R3 (Interleukine-1
receptor accessory protein, IL-1RacP). Samen vormen ze het IL-1-receptorencomplex. Wanneer IL-1β
bindt aan IL-1R1, induceert dit een conformationele verandering die IL-1R1 in staat stelt te binden
aan IL-1R3, wat leidt tot dimerisatie van het receptorcomplex.
Receptorheterodimerisatie (receptor-ligand binding) :
1) contact met extracellulair deel van IL-1R1 receptor (PDB code : 1ITB)
Deze eiwit-eiwit-interactie gebeurt met hoge affiniteit (lage KD (dissociatieconst), nM)
2) Induceert een conformationele verandering in de primaire receptor.
3) Hierdoor kan IL-1R1 binden op de co-receptor IL-1R3 (= IL-1RacP).
Resulteert in de cel in interactie van het receptorcomplex met cytoplasmatische
signaaleiwitten. Hierdoor start een complexe signaalcascade
Dit resulteert uiteindelijk in de activatie van transcriptiefactoren, waaronder de
transcriptiefactor Nucleaire Factor kappa-B : NF-κB
Deze receptor-ligandbinding initieert een complexe signaalcascade binnen de cel, resulterend in de
activering van transcriptiefactoren zoals Nucleaire Factor kappa-B (NF-κB). NF-κB activeert genen die
betrokken zijn bij inflammatie en immuunresponsen.
Een natuurlijke regulator van IL-1β is IL-1Ra (Interleukine 1 receptor antagonist), die kan binden aan
IL-1R1 zonder dimerisatie met IL-1R3 te veroorzaken. Hierdoor wordt receptoractivatie voorkomen en
wordt intracellulaire signalisatie geblokkeerd. IL-1Ra werkt dus als een competitieve inhibitor van
IL-1β.
Een overmatige expressie van IL-1β is geassocieerd met verschillende inflammatoire aandoeningen.
Om deze reden worden IL-1β-antagonisten in de kliniek gebruikt voor de behandeling van
aandoeningen zoals reumatoïde artritis. Bovendien wordt onderzocht of het remmen van IL-1β een
rol kan spelen bij de behandeling van atherosclerose en verschillende vormen van kanker.
Gen Transcript Precursor eiwit Mature eiwit
Interleukine 1 beta 1507 bp Interleukine 1 beta Intracellulair :
proprotein gesecreteerd
IL1B 7 exonen 269 AZ 153 AZ
Chromosoom 2 CDS : 88-897 17,4 kD (Da = g/mol)
B- streng configuratie
4
,Humaan EVL
Is een actine geassocieerd cytosolische eiwit. Actinecelskelet is belangrijk voor celbeweging, vorm en
interactie. EVL verbetert actine nucleatie en polymerisatie. ENA/Vasp eiwitten zijn aanwezig in regio’s
van de cel waarin de actinedynamica doorgaat en spelen hierin een regulerende rol.
Multidomein eiwit: bestaat uit 3 domeinen :
1) Het N-terminale EVH1 (Ena/VASP homologie 1)-domein is een domein dat EVL lokaliseert in
bepaalde delen van de cel (onder ander aan de celmembraan).
2) De centrale regio van EVL wordt poly-L-proline (PLP)-regio genoemd omwille van een
uitzonderlijk hoog aantal proline aminozuren (Pro, P). Deze regio bindt verschillende
signaaleiwitten en ook het actinebindend eiwit profiline.
3) Het C-terminale EVH2-domein bindt actine (zowel aparte actine-eiwitten als actinefilamenten
en bevat ook een deel dat zorgt dat EVL-tetrameren worden gevormd
Door de rol in celbeweging is EVL belangrijk voor migratie van T-cellen doorheen de bloedvatwand
naar plaatsen van inflammatie, in uitgroei van zenuwcellen (axonvorming) maar ook in
bloedvatvorming (angiogenese) tijdens ontwikkeling. Verstoorde expressie van het EVL eiwit is ook
geassocieerd met verschillende invasieve kankers
Gen Transcript Eiwit
Enah/Vasp-Like 1834 bp cytoplasma
EVL 14 exonen Ena/VASP-like proteïne
Chromosoom 14 CDS : 80-1336 418 AZ
44,62 kD (Da = g/mol)
PTM : fosforylering door PKA (Protein Kinase A)
5
,Onderzoekslijn 1
Doel
Een recombinant plasmide kan aan heterologe expressie van eiwitten doen. Heterologe expressie
verwijst naar het proces waarbij een gen van een organisme A wordt ingebracht en tot expressie
wordt gebracht in een organisme B. In deze onderzoekslijn is het doel een recombinant plasmide aan
te maken dat zal toelaten om bacteriën (E. coli ) het humane eiwit IL-1β te laten maken via
heterologe expressie. Daartoe wordt de geschikte coderende sequentie van dit eiwit in de polylinker
(MCS) van een welbepaald plasmide, genaamd pET30a, gekloneerd. Dit wordt uitgevoerd over 4
dagen.
Uit de theorie weten jullie dat bij een klonering gebruik kan gemaakt worden van het knip en plak-
principe: Een plasmide wordt opengeknipt met restrictie-enzymen en de coderende sequentie van
interesse wordt in het plasmide geplakt met behulp van een ligase. Dit ligatieproces verloopt niet
100% efficiënt waardoor steeds een mengsel van plasmiden (= ligatiemengsel) bekomen wordt
waarin enerzijds het oorspronkelijk plasmide aanwezig is (zonder insert: pET30a) en het nieuw
gemaakte plasmide (met insert: pET30a-hIL-1β). Het is de bedoeling om uit het mengsel het
gewenste plasmide op te zuivere en om de efficiëntie van de klonering te bepalen (wat is de
verhouding in het ligatiemengsel van plasmide met insert en plasmide zonder insert).
Competente bacteriën Ligatiemengsel
Transformatie en uitplaten (dag 1)
Overnacht incubatie na uitplaten (dag 1)
Methode 1 : Colony PCR (dag 2) Methode 2: Vloeibare cultuur (dag 2)
Plasmide isolatie (dag 3)
Restrictiedigest (dag 3)
Agarose gelelektroforese (dag 4)
Resultaten en interpreteren
Opdracht 2 : DEEL A : Vergelijkende analyse van gebruikte plasmiden
BASISTERMINOLOGIE
Om humaan IL-1β recombinant aan te maken in bacteriën, werd een specifiek deel van de
coderende DNA sequentie (CDS) van het eiwit gekloneerd in de pET30a prokaryote expressievector.
Het resulterende plasmide wordt pET30a-hIL-1 of pET30a-hIL-1b genoemd.
Ori Insert in MCS
MCS Lac operator (hier bind
(herkenningsplaatsen LacI
voor restrictie-enzym)
T7 promotor LacI : Lac repressor gen
(stroomopwaarts van
insert)
Selectable marker : om T7 terminator : einde
cellen te kiezen die het transcriptie zodat RNA-
plasmide hebben polymerase DNA loslaat
opgenomen
6
, ANALYSE VAN DE SEQUENTIE VAN VECTOR pET30a
Vector : 5418 bp
- Transcriptie : door RNA polymerase (II bij eukaryoten)
- Translatie : door tRNA en ribosoom
Regulerende elementen Rol Grootte
T7 promotor Start transcriptie 19 bp
T7 terminator Stop transcriptie 48 bp
Lac operator Regelen transcriptie 25 bp
RBS met Shine Delgarno (SD) Binden ribosoom voor 6 bp
Sequentie : AGGAGA translatie
Startcodon : ATG (AUG) Start translatie 3 bp
Stopcodon : TGA (UGA) Stop translatie 3 bp
ANALYSE SELECTABLE MARKER
Een antibioticaresistentie gen : KanR : 816 bp en 272 AZ
- Kanamycine bindt normaal op ribosoom zodat deze geen translatie meer kan uitvoeren en de
bacterie zijn eigen noodzakelijke eiwitten niet meer kan maken en sterft. Dus Kanamycine
inhibeert de proteïne synthese binnen een bacterie.
- Het resitentiegen KanR maakt neomycine fosfotransferase II (=kinase) (NPTII) (een
enzym/eiwit) aan die een fosforgroep zal plaatsen op kanamycine waardoor kanamycine
polairder en negatief wordt. Omdat kanamycine oorspronkelijk neutraal geladen zal deze niet
meer mooi binden op het ribosoom waardoor de bacterie wel zijn eigen eiwitten kan
aanmaken en overleeft : inactivatie door fosforilisatie.
- Bacterien met het plasmide met KanR als selectable marker overleven in Kanamycine
- Kan gebruikt worden voor bacteriën en eukaryotische cellen en is ook vrij stabiel.
ANALYSE EXPRESSIEPLASMIDE pET30-hIL-1B
Vector : 5709 bp
CDS voor hIL-1B : 461 bp
Restrictie-enzymen NdeI (bij startcodon) en NotI (redelijk veel voor stopcodon) : insert kleiner dan
afstand tussen start- en stopcodon
CDS voor IL1 : 154 AZ : Het insert heeft 1 AZ meer voor Methionine zodat tRNA complementair is om
te binden op de P plaats om translatie te initiëren. Het actief eiwit wordt gebruikt zodat caspase 1
geen protease hoeft uit te voeren om het mature te verkrijgen.
EXTRA UITLEG
Wat is onderscheid van cDNA en CDS
- cDNA= copyDNA → DNA bekomen nadat mRNA transcript is omgezet in DNA via reverse
transcriptie door reverse transcriptase met een oligo-dt primer
- CDS= coderende DNA sequentie → sequentie die codeert voor eiwit, die door een ribosoom
vertaald wordt.
Hoe werkt SD ( Shine Delgarno sequentie)
- Sequentie AGGAGA in mRNA die 5-A10 nucleotiden voor het AUG startcodon ligt
- Is voor het selecteren van het startcodon => het eerste 5’AUG triplet is niet perse het
startcodon => bij prokaryoten kunnen transcripten polycistronisch zijn = genetische
informatie voor meer dan 1 eiwit
7
Inhoud
Inleiding : opdracht 1............................................................................................................................... 4
Interleukine 1 ...................................................................................................................................... 4
Humaan EVL ........................................................................................................................................ 5
Onderzoekslijn 1 ...................................................................................................................................... 6
Doel ..................................................................................................................................................... 6
Opdracht 2 : DEEL A : Vergelijkende analyse van gebruikte plasmiden .............................................. 6
BASISTERMINOLOGIE ...................................................................................................................... 6
ANALYSE VAN DE SEQUENTIE VAN VECTOR pET30a ........................................................................ 7
ANALYSE SELECTABLE MARKER........................................................................................................ 7
ANALYSE EXPRESSIEPLASMIDE pET30-hIL-1B .................................................................................. 7
EXTRA UITLEG .................................................................................................................................. 7
SOP 1 : LB-agar platen gieten .............................................................................................................. 8
INLEIDING ........................................................................................................................................ 8
BENODIGDHEDEN ............................................................................................................................ 8
PROTOCOL ....................................................................................................................................... 8
SOP 2 : transformatie van bacteriën.................................................................................................... 9
INLEIDING ........................................................................................................................................ 9
BENODIGDHEDEN ............................................................................................................................ 9
PROTOCOL ....................................................................................................................................... 9
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 10
Opdracht 2 : DEEL B : in silico voorbereiden van colony PCR ............................................................ 10
PRIMERS ANALYSE ......................................................................................................................... 10
SOP 3 : Colony PCR ............................................................................................................................ 10
INLEIDING ...................................................................................................................................... 10
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 10
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 11
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 11
Opdracht 2 : DEEL C : in silico restrictiedigest van de plasmiden ...................................................... 11
RESTRICTIEDIGEST ......................................................................................................................... 11
DIGEST IN SILICO............................................................................................................................ 12
SOP 4 : Miniprep : plasmide DNA-bereiding ..................................................................................... 12
INLEIDING ...................................................................................................................................... 12
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 13
1
, PROTOCOL ..................................................................................................................................... 13
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 14
SOP 5 : Restrictiedigest ...................................................................................................................... 14
INLEIDING ...................................................................................................................................... 14
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 14
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 14
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 15
SOP 6 : Agarosegelelektroforese ....................................................................................................... 15
INLEIDING ...................................................................................................................................... 15
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 16
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 16
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 16
Resultaten onderzoekslijn 1 .............................................................................................................. 16
Onderzoekslijn 2 .................................................................................................................................... 17
Doel ................................................................................................................................................... 17
Opdracht 3 : DEEL A : inductie van recombinante eiwitproductie .................................................... 17
EIGENSCHAPPEN VAN RECOMBINANTE EIWITPRODUCTIE ........................................................... 17
EXTRA REGULERENDE ELEMENTEN ............................................................................................... 18
AANSWITCHEN VAN RECOMBINANTE EIWITPRODUCTIE .............................................................. 18
ANALYSE VAN RECOMBINANTE EXPRESSIE.................................................................................... 19
RECOMBINANTE EXPRESSIE VAN HUMAAN EVL ........................................................................... 20
SOP 7 : SDS-page ............................................................................................................................... 20
INLEIDING ...................................................................................................................................... 20
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 21
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 22
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 22
Resultaten onderzoekslijn 2 .............................................................................................................. 22
Opdracht 4 : Kloneren via benchling voor in silico ............................................................................ 22
STAP 1 : VOORBEREIDING .............................................................................................................. 22
STAP 2 : IN SILICO KNIPPEN EN PLAKKEN ...................................................................................... 23
Onderzoekslijn 3 .................................................................................................................................... 26
Doel ................................................................................................................................................... 26
Opdracht 3 : DEEL B : recombinante eiwitproductie ......................................................................... 26
TAGGEN VAN hIL-1B EN EVL EIWIT ................................................................................................ 26
ROL VAN TAGGING BIJ EIWITZUIVERING VIA AFFINITY PURIFICATION ......................................... 26
SOP 8 : concentratiebepaling : Bradford assay .................................................................................. 27
2
, INLEIDING ...................................................................................................................................... 27
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 28
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 28
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 28
SOP 10 : ELISA variant voor humaan EVL .......................................................................................... 29
INLEIDING ...................................................................................................................................... 29
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 31
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 31
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 32
Resultaten onderzoekslijn 3 .............................................................................................................. 32
Onderzoekslijn 4 .................................................................................................................................... 33
Doel : ................................................................................................................................................. 33
Opdracht 6 : ....................................................................................................................................... 33
SOP 9 : ............................................................................................................................................... 35
INLEIDING ...................................................................................................................................... 35
BENODIGDHEDEN .......................................................................................................................... 36
PROTOCOL ..................................................................................................................................... 36
OPMERKINGEN .............................................................................................................................. 37
Resultaten onderzoekslijn 4 .............................................................................................................. 37
Opdracht 5 : ....................................................................................................................................... 37
3D-STRCUTUUR VAN EVL EIWIT .................................................................................................... 37
3D STRUCTUUR VAN HUMAAN IL-1B ............................................................................................ 37
3D STRUCTUUR VAN COMPLEX HUMAAN IL-1B EN MEMBRAANRECEPTOR ................................ 38
AMINOZUREN IN RECEPTOR EN LIGAND ....................................................................................... 38
3
,Inleiding : opdracht 1
Interleukine 1
Interleukine 1 (IL-1) is een pro-inflammatoire cytokine die essentieel is voor de communicatie binnen
het immuunsysteem. Het wordt geproduceerd door immuuncellen en speelt een belangrijke rol bij
het reguleren van de aangeboren immuniteit. IL-1 bevordert onder andere T-cel activatie,
collageenproductie en fibroblastproliferatie, en veroorzaakt een stijging van de lichaamstemperatuur.
Het gen interleukine 1 beta (IL1B) codeert voor een inactief precursor-eiwit genaamd pro-IL-1β. Dit
eiwit wordt wanneer het protease caspase-1 inwerkt heomzet in het actieve IL-1β-eiwit, dat
vervolgens door cellen wordt uitgescheiden. Het actieve IL-1β-eiwit bestaat uit één domein en verlaat
de cel niet via de normale secretorische route vanwege het ontbreken van een signaalpeptide.
IL-1β bindt aan transmembraanreceptoren die heterodimeren vormen, namelijk de primaire
membraanreceptor IL-1R1 (Interleukine 1 receptor type I) en de coreceptor IL-1R3 (Interleukine-1
receptor accessory protein, IL-1RacP). Samen vormen ze het IL-1-receptorencomplex. Wanneer IL-1β
bindt aan IL-1R1, induceert dit een conformationele verandering die IL-1R1 in staat stelt te binden
aan IL-1R3, wat leidt tot dimerisatie van het receptorcomplex.
Receptorheterodimerisatie (receptor-ligand binding) :
1) contact met extracellulair deel van IL-1R1 receptor (PDB code : 1ITB)
Deze eiwit-eiwit-interactie gebeurt met hoge affiniteit (lage KD (dissociatieconst), nM)
2) Induceert een conformationele verandering in de primaire receptor.
3) Hierdoor kan IL-1R1 binden op de co-receptor IL-1R3 (= IL-1RacP).
Resulteert in de cel in interactie van het receptorcomplex met cytoplasmatische
signaaleiwitten. Hierdoor start een complexe signaalcascade
Dit resulteert uiteindelijk in de activatie van transcriptiefactoren, waaronder de
transcriptiefactor Nucleaire Factor kappa-B : NF-κB
Deze receptor-ligandbinding initieert een complexe signaalcascade binnen de cel, resulterend in de
activering van transcriptiefactoren zoals Nucleaire Factor kappa-B (NF-κB). NF-κB activeert genen die
betrokken zijn bij inflammatie en immuunresponsen.
Een natuurlijke regulator van IL-1β is IL-1Ra (Interleukine 1 receptor antagonist), die kan binden aan
IL-1R1 zonder dimerisatie met IL-1R3 te veroorzaken. Hierdoor wordt receptoractivatie voorkomen en
wordt intracellulaire signalisatie geblokkeerd. IL-1Ra werkt dus als een competitieve inhibitor van
IL-1β.
Een overmatige expressie van IL-1β is geassocieerd met verschillende inflammatoire aandoeningen.
Om deze reden worden IL-1β-antagonisten in de kliniek gebruikt voor de behandeling van
aandoeningen zoals reumatoïde artritis. Bovendien wordt onderzocht of het remmen van IL-1β een
rol kan spelen bij de behandeling van atherosclerose en verschillende vormen van kanker.
Gen Transcript Precursor eiwit Mature eiwit
Interleukine 1 beta 1507 bp Interleukine 1 beta Intracellulair :
proprotein gesecreteerd
IL1B 7 exonen 269 AZ 153 AZ
Chromosoom 2 CDS : 88-897 17,4 kD (Da = g/mol)
B- streng configuratie
4
,Humaan EVL
Is een actine geassocieerd cytosolische eiwit. Actinecelskelet is belangrijk voor celbeweging, vorm en
interactie. EVL verbetert actine nucleatie en polymerisatie. ENA/Vasp eiwitten zijn aanwezig in regio’s
van de cel waarin de actinedynamica doorgaat en spelen hierin een regulerende rol.
Multidomein eiwit: bestaat uit 3 domeinen :
1) Het N-terminale EVH1 (Ena/VASP homologie 1)-domein is een domein dat EVL lokaliseert in
bepaalde delen van de cel (onder ander aan de celmembraan).
2) De centrale regio van EVL wordt poly-L-proline (PLP)-regio genoemd omwille van een
uitzonderlijk hoog aantal proline aminozuren (Pro, P). Deze regio bindt verschillende
signaaleiwitten en ook het actinebindend eiwit profiline.
3) Het C-terminale EVH2-domein bindt actine (zowel aparte actine-eiwitten als actinefilamenten
en bevat ook een deel dat zorgt dat EVL-tetrameren worden gevormd
Door de rol in celbeweging is EVL belangrijk voor migratie van T-cellen doorheen de bloedvatwand
naar plaatsen van inflammatie, in uitgroei van zenuwcellen (axonvorming) maar ook in
bloedvatvorming (angiogenese) tijdens ontwikkeling. Verstoorde expressie van het EVL eiwit is ook
geassocieerd met verschillende invasieve kankers
Gen Transcript Eiwit
Enah/Vasp-Like 1834 bp cytoplasma
EVL 14 exonen Ena/VASP-like proteïne
Chromosoom 14 CDS : 80-1336 418 AZ
44,62 kD (Da = g/mol)
PTM : fosforylering door PKA (Protein Kinase A)
5
,Onderzoekslijn 1
Doel
Een recombinant plasmide kan aan heterologe expressie van eiwitten doen. Heterologe expressie
verwijst naar het proces waarbij een gen van een organisme A wordt ingebracht en tot expressie
wordt gebracht in een organisme B. In deze onderzoekslijn is het doel een recombinant plasmide aan
te maken dat zal toelaten om bacteriën (E. coli ) het humane eiwit IL-1β te laten maken via
heterologe expressie. Daartoe wordt de geschikte coderende sequentie van dit eiwit in de polylinker
(MCS) van een welbepaald plasmide, genaamd pET30a, gekloneerd. Dit wordt uitgevoerd over 4
dagen.
Uit de theorie weten jullie dat bij een klonering gebruik kan gemaakt worden van het knip en plak-
principe: Een plasmide wordt opengeknipt met restrictie-enzymen en de coderende sequentie van
interesse wordt in het plasmide geplakt met behulp van een ligase. Dit ligatieproces verloopt niet
100% efficiënt waardoor steeds een mengsel van plasmiden (= ligatiemengsel) bekomen wordt
waarin enerzijds het oorspronkelijk plasmide aanwezig is (zonder insert: pET30a) en het nieuw
gemaakte plasmide (met insert: pET30a-hIL-1β). Het is de bedoeling om uit het mengsel het
gewenste plasmide op te zuivere en om de efficiëntie van de klonering te bepalen (wat is de
verhouding in het ligatiemengsel van plasmide met insert en plasmide zonder insert).
Competente bacteriën Ligatiemengsel
Transformatie en uitplaten (dag 1)
Overnacht incubatie na uitplaten (dag 1)
Methode 1 : Colony PCR (dag 2) Methode 2: Vloeibare cultuur (dag 2)
Plasmide isolatie (dag 3)
Restrictiedigest (dag 3)
Agarose gelelektroforese (dag 4)
Resultaten en interpreteren
Opdracht 2 : DEEL A : Vergelijkende analyse van gebruikte plasmiden
BASISTERMINOLOGIE
Om humaan IL-1β recombinant aan te maken in bacteriën, werd een specifiek deel van de
coderende DNA sequentie (CDS) van het eiwit gekloneerd in de pET30a prokaryote expressievector.
Het resulterende plasmide wordt pET30a-hIL-1 of pET30a-hIL-1b genoemd.
Ori Insert in MCS
MCS Lac operator (hier bind
(herkenningsplaatsen LacI
voor restrictie-enzym)
T7 promotor LacI : Lac repressor gen
(stroomopwaarts van
insert)
Selectable marker : om T7 terminator : einde
cellen te kiezen die het transcriptie zodat RNA-
plasmide hebben polymerase DNA loslaat
opgenomen
6
, ANALYSE VAN DE SEQUENTIE VAN VECTOR pET30a
Vector : 5418 bp
- Transcriptie : door RNA polymerase (II bij eukaryoten)
- Translatie : door tRNA en ribosoom
Regulerende elementen Rol Grootte
T7 promotor Start transcriptie 19 bp
T7 terminator Stop transcriptie 48 bp
Lac operator Regelen transcriptie 25 bp
RBS met Shine Delgarno (SD) Binden ribosoom voor 6 bp
Sequentie : AGGAGA translatie
Startcodon : ATG (AUG) Start translatie 3 bp
Stopcodon : TGA (UGA) Stop translatie 3 bp
ANALYSE SELECTABLE MARKER
Een antibioticaresistentie gen : KanR : 816 bp en 272 AZ
- Kanamycine bindt normaal op ribosoom zodat deze geen translatie meer kan uitvoeren en de
bacterie zijn eigen noodzakelijke eiwitten niet meer kan maken en sterft. Dus Kanamycine
inhibeert de proteïne synthese binnen een bacterie.
- Het resitentiegen KanR maakt neomycine fosfotransferase II (=kinase) (NPTII) (een
enzym/eiwit) aan die een fosforgroep zal plaatsen op kanamycine waardoor kanamycine
polairder en negatief wordt. Omdat kanamycine oorspronkelijk neutraal geladen zal deze niet
meer mooi binden op het ribosoom waardoor de bacterie wel zijn eigen eiwitten kan
aanmaken en overleeft : inactivatie door fosforilisatie.
- Bacterien met het plasmide met KanR als selectable marker overleven in Kanamycine
- Kan gebruikt worden voor bacteriën en eukaryotische cellen en is ook vrij stabiel.
ANALYSE EXPRESSIEPLASMIDE pET30-hIL-1B
Vector : 5709 bp
CDS voor hIL-1B : 461 bp
Restrictie-enzymen NdeI (bij startcodon) en NotI (redelijk veel voor stopcodon) : insert kleiner dan
afstand tussen start- en stopcodon
CDS voor IL1 : 154 AZ : Het insert heeft 1 AZ meer voor Methionine zodat tRNA complementair is om
te binden op de P plaats om translatie te initiëren. Het actief eiwit wordt gebruikt zodat caspase 1
geen protease hoeft uit te voeren om het mature te verkrijgen.
EXTRA UITLEG
Wat is onderscheid van cDNA en CDS
- cDNA= copyDNA → DNA bekomen nadat mRNA transcript is omgezet in DNA via reverse
transcriptie door reverse transcriptase met een oligo-dt primer
- CDS= coderende DNA sequentie → sequentie die codeert voor eiwit, die door een ribosoom
vertaald wordt.
Hoe werkt SD ( Shine Delgarno sequentie)
- Sequentie AGGAGA in mRNA die 5-A10 nucleotiden voor het AUG startcodon ligt
- Is voor het selecteren van het startcodon => het eerste 5’AUG triplet is niet perse het
startcodon => bij prokaryoten kunnen transcripten polycistronisch zijn = genetische
informatie voor meer dan 1 eiwit
7
